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猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的猪的急性致死性传染病。PR广泛分布于世界各国,是当前危害养猪业的一种最为严重的病毒性疾病,给养猪产业造成巨额经济损失。20世纪90年代以来通过基因缺失疫苗的广泛使用及鉴别诊断方法的应用使PR在我国猪场得到有效控制,但自2011年底以来,我国多省份的免疫Bartha-K61疫苗的猪场陆续暴发PR,山东各地区免疫Bartha-K61疫苗的猪场也相继发生PR,造成母猪繁殖障碍,新生仔猪出现神经症状和高死亡率。2014年11月份至2015年3月,本研究从山东4个地区的5个疑似PR发病的规模化猪场采集的病料样品中分离多株PRV野毒株,对其中分离自山东齐河地区的PRV毒株进行了全基因组测序及遗传变异分析。1、猪伪狂犬病病毒分离和鉴定2014年11月份至2015年3月,样品采集自山东济南、齐河、沂水、费县4个地区5个疑似PR发病猪场。将组织样品匀浆,应用荧光定量PCR方法检测,确定为PRV野毒感染。组织匀浆上清过滤除菌,接种到PK15细胞上,接种约8h细胞开始出现变圆、合胞体等典型病变。分离病毒经蚀斑纯化,在PK15细胞上连续传代增殖,并提取收获的细胞培养液的DNA,使用gE基因特异性引物鉴定显示所分离的PRV毒株为野毒株。将分离5株PRV分别命名为Qihe547、SDYS1、SDYS2、SDFX、SDJN,其中Qihe547株在PK15细胞上TCID50达到10-7.0/0.1ml。将PRV分离株细胞培养液接种体重2㎏母兔出现奇痒、啃咬接种部位、尖叫等典型临床症状,并很快死亡。2、Qihe547分离株全基因组测序本研究根据PRV Becker(JF797219)全基因组序列先后共设计200多对引物,每对引物之间均包含重叠序列。以提取的PRV Qihe547株DNA为模板,应用PCR方法进行扩增、测序。将各片段序列拼接,得到全长为143404bp的Qihe547基因组序列,并对全基因组中的基因进行了定位和注释。3、Qihe547分离株基因组中各基因的比对分析为了解Qihe547株基因组中各基因的变异情况,我们对Qihe547株的全基因组序列与GenBank中登陆的PRV全基因组序列进行比对分析并筛选各基因序列与参考序列进行比对分析。基于Qihe547株全基组序列比对分析发现,Qihe547株与国内PRV分离株的同源性高于其与国外PRV分离株的同源性,同时在系统发生树中其与国内其他PRV分离株处于独立分支中,同时发现Qihe547株属目前PRV基因分型中的基因Ⅱ型。我们对Qihe547株的主要的保护性抗原基因gB、gC、gD基因进行比对分析,同时对gB、gC、gD的糖基化位点和抗原表位进行分析。结果显示,Qihe547分离株gB、gC、gD的氨基酸序列中均存在氨基酸的插入或缺失,gB 75SPG77 3个氨基酸的缺失,94G的插入;gC 63AAASTPA69 7个氨基酸的插入;gD 278RP279 2个氨基酸的插入。与Bartha株相比,Qihe547分离株在gB的优势抗原表位区(aa59~aa126)、gC膜外区(aa23~aa453)和gD主要抗原表位区,潜在的抗原位点及潜在O-糖基化位点存在明显变异,推测这些变异可能影响Qihe547分离株的抗原性,可能利于病毒逃避宿主免疫反应。对Qihe547株基因组中其他结构蛋白基因和非结构蛋白的分析发现,这些基因的氨基酸序列中存在不同程度的变异,其中与PRV复制、基因表达调节相关的非结构蛋白基因的变异较大。对PRV Qihe547及其他国内外PRV分离株基因组中重复序列统计分析显示,其在国内外PRV分离株的编码区和非编码区的分布存在差异,这些差异可能影响到基因的表达、转录及蛋白质功能的发挥。本研究促进了对目前PRV流行毒株遗传变异情况的了解和认识并为PR的防控及PRV疫苗的研制提供了依据。