论文部分内容阅读
目的：通过大肠杆菌表达系统高效表达重组人成纤维细胞生长因子6（rhFGF6）蛋白，优化并建立高密度培养技术及包涵体形式表达蛋白的变复性纯化技术，获得高纯度的rhFGF6蛋白。利用MTT法测定其生物学活性和Western Blot技术分析相关基因和蛋白的表达情况，研究其对H2O2诱导建立心肌细胞氧化应激损伤模型的保护作用及其抗凋亡机制。 方法：⑴将合成的fgf6全基因，与pET-3a载体连接，构建pET3a-rhFGF6重组克隆载体。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态中制备工程菌株。通过流加培养，建立高密度发酵培养方法，并建立高压均质破碎菌体方法。⑵对包涵体洗涤及8 M脲变性后，在SP阳离子交换柱上采用柱上复性的方法对其进行复性和纯化，再利用肝素亲和层析柱进行进一步的纯化。⑶得到高纯度重组蛋白后，进行生物学活性检测。利用MTT法分别检测rhFGF6蛋白对NIH3T3细胞、C2C12细胞和H9c2细胞的促增殖作用。⑷为研究FGF6的心肌保护作用，利用H2O2诱导H9c2细胞建立氧化应激损伤模型，检测其促增殖和抗凋亡作用，并进一步通过Western Blot技术分析增殖和凋亡相关基因和蛋白的表达来研究其保护作用机制。 结果：①通过筛选获得高表达的工程菌株并制备成甘油菌保存。通过优化发酵生产工艺获得菌体密度达62.3g/L发酵液，目的蛋白表达量占菌体总蛋白的15％以上。可溶性分析结果目的蛋白大部分以包涵体蛋白形式表达。②经过包涵体洗涤、变性后，利用柱上复性方式进行蛋白复性及纯化，得到了纯度为97%的rhFGF6蛋白，纯化收率为110mg/L发酵液。③细胞活性检测证实，纯化的rhFGF6蛋白能促进NIH3T3细胞的生长，显著促进C2C12细胞的生长并存在一定的剂量依赖性。但对正常H9c2细胞的促增殖作用并不明显。④通过MTT法及检测LDH和MDA含量，证明rhFGF6蛋白对心肌损伤细胞模型有抗凋亡的保护作用，进一步利用Western Blot技术证实rhFGF6蛋白对心肌氧化损伤的保护作用机制是通过MAPK-Caspase-3通路实现的。 结论：成功利用E.coli表达系统诱导表达rhFGF6蛋白，并通过柱上复性及色谱柱层析获得高纯度、具有生物学活性的rhFGF6蛋白。纯化后的rhFGF6蛋白对NIH3T3和C2C12细胞有显著的促增殖活性，并证明是通过MAPK-Caspase-3通路以促增殖、抗凋亡的形式实现对氧化应激损伤的心肌细胞的保护作用。