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丙酮酸氧化酶是一种十分重要的试剂用酶,在生化检测等领域有重要应用。来自野生型菌株如绿色气球菌、植物乳杆菌等的丙酮酸氧化酶产量很低,为120 U/L。本论文以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,通过基因工程的手段将绿色气球菌的丙酮酸氧化酶基因在大肠杆菌中进行表达,以提高丙酮酸氧化酶的产量。主要的研究结果有:(1)据NCBI获得的绿色气球菌丙酮酸氧化酶的基因序列,以合成的绿色气球菌丙酮酸氧化酶基因片段作为模板,PCR获得目的片段,将其插入到3个载体中,转化大肠杆菌后,获得重组大肠杆菌分别为pET25b-pod、pET28a-pod和pET32a-pod。对3种重组大肠杆菌进行发酵条件优化,结果表明重组大肠杆菌pET28a-pod在0.5 mmol/L IPTG,25℃诱导,初始重组大肠杆菌浓度0.5 OD600的条件下诱导24h后,丙酮酸氧化酶的活力达到了 4106.9U/L。另外2种重组大肠杆菌pET25b-pod和pET28a-pod在经过优化后,丙酮酸氧化酶活力分别为650.1和1812.6 U/L。对重组大肠杆菌pET28a-pod表达的丙酮酸氧化酶进行镍柱纯化,经过100 mmol/L咪唑洗脱得到88.89%的可溶性丙酮酸氧化酶,再用500 mmol/L咪唑溶液洗脱得到剩余的9.99%的目标蛋白。(2)对重组大肠杆菌pET28a-pod进行优化培养,在装液量为25 mL的条件下,丙酮酸氧化酶活力随着诱导时间的延长急剧下降,96.91%的可溶性丙酮酸氧化酶转变为包涵体。结果表明发酵液pH的变化,最终导致丙酮酸氧化酶活力的下降。最后将发酵液恒定为pH 6.0,补加甘油诱导64 h后,重组大肠杆菌表达丙酮酸氧化酶活力达到21243.3 U/L。(3)通过共表达SecB伴侣蛋白促进丙酮酸氧化酶向胞外分泌,再通过甘氨酸强化胞内丙酮酸氧化酶向胞外的渗漏,最后利用铜离子提高酶的稳定性。本部分实验构建了分泌表达载体pRD-pd和三种不同启动子控制SecB蛋白的载体pRD-pod-T7-secb、pRD-pod-lac-secb、pRD-pod-Bla-secb,探究不同 SecB 蛋白含量对丙酮酸氧化酶分泌表达的影响。通过IPTG浓度优化实验得到重组大肠杆菌pRD-pod-Bla-secb诱导24h后,胞外丙酮酸氧化酶活力达到646.9U/L。在此基础上对pRD-pod-Bla-secb进行发酵优化,在25℃诱导、初始细胞浓度0.5 OD600和pH 7.0的条件下,胞外丙酮酸氧化酶活力达到了 795.7 U/L。进一步添加3%甘氨酸和0.02 mmol/L CuSO4,诱导48 h后,胞外丙酮酸氧化酶活力达到2926.3 U/L。本文通过基因工程的手段构建了表达丙酮酸氧化酶的重组大肠杆菌,通过改变发酵条件提高了丙酮酸氧化酶活力,并进一步研究了重组大肠杆菌分泌表达丙酮酸氧化酶。