ski是Stavanezer等人于1986年首先在感染了禽类白血病转化缺陷病毒Bratislava77的鸡胚细胞中发现的。它在不同类型的细胞和组织中分布广泛,尤其在多种肿瘤细胞中均存在着过量的异常表达。ski作为细胞内的原癌基因,具有多种生物活性,参与体内多种生理病理过程。对Ski蛋白生物活性及在各种恶性肿瘤发生发展过程中作用机制的研究是目前生命科学领域的一大热点。那么进一步探索ski对肿瘤细胞生物学功能的影响对于上述命题则具有重要的意义。 ski是TGF-β通路的主要负性调控因子,它通过抑制Smad家族复合物来拮抗TGF-β对细胞生长的抑制作用,与肿瘤的发生发展关系密切。 研究表明Ski蛋白具有促进细胞恶性转化的作用。由于其没有内在的催化活性,所以必须通过与其他细胞成分如Smad蛋白的相互作用来实现这一功能,而TGF-βSmads传导通路是已知与Ski致瘤作用关系最为密切的家族之一。同时,大量临床病例显示,Ski在肿瘤发生发展中的作用是复杂的：一方面,在人类许多肿瘤如恶性黑色素瘤、乳腺癌、食道癌、肺癌、胃癌、表皮样瘤及前列腺癌中均已发现Ski的过量异常表达,并被证实是食道癌、乳腺癌、大肠癌预后不良的重要因素之一；另一方面,Ski在少数情况下有一定的肿瘤抑制作用,如鼠ski的非等位缺失能提高其对化学诱癌的敏感性。Ski是TGF-β通路的主要负性调控因子,它在肿瘤发生过程中的多样性与TGF-β对肿瘤的双重作用(早期抑制,中后期促进侵润和转移)之间是否存在着重大关系,是目前分子医学急需攻克的难题。 本实验室的前期研究发现,Ski在人肝癌HepG2细胞中异常高度表达,表达量是人正常肝细胞LO2的18倍左右,提示Ski与肝癌的发生关系密切,所以ski有可能成为肝癌治疗的新型靶点。考虑到ski广泛参与多种重要的生命活动,加之目前尚无关于ski与肝癌细胞增殖、凋亡等功能关系的报道,因此本课题着眼于ski对肝癌细胞生物学功能影响的研究。 鉴于RNA干扰技术是研究基因功能的强大工具,目前被广泛应用于生命科学的各项研究。所以本课题选用针对ski的小分子RNA干扰片段瞬间转染人肝癌HepG2细胞,剔降胞内ski表达水平来监控肝癌细胞生物学功能方面指标的变化。相信这一研究将对肿瘤基因治疗提供了一条新的思路和方法。 我们设计并化学合成针对原癌基因ski的3个siRNA分子序列,阳离子脂质体法瞬间转染HepG2细胞,运用实时定量PCR法和Western-Blotting法检测细胞中ski在mRNA水平和蛋白水平的变化。然后利用MTT法和流式细胞仪检测转染ski-siRNA的HepG2细胞的增殖、周期和凋亡等生物学功能方面指标的变化。课题研究的内容包括以下三个主要部分： 1.瞬间转染hski-siRNA研究HepG2细胞中ski mRNA水平和蛋白水平的表达; 2.siRNA干扰ski的表达对人肝癌HepG2细胞生物学功能的影响; 3.ski-siRNA对Ski下游周期相关蛋白表达的调节 通过实验发现,三对特异性ski-siRNA均有效的抑制ski的表达,以siRNA-B抑制效果最好,可达到70％,而且随着转染时间的延长,ski的表达呈逐步下降趋势。HepG2细胞的增殖能力明显受到抑制(P<0.05),S期细胞明显减少,是阴性对照组的2倍以上。但凋亡效果并不明显。而且ski基因沉默后,TGF-β通路下游的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p15,p27的蛋白表达随转染时间的延长均明显下调,而p21蛋白的改变不大。因此可知,靶向ski基因的siRNA分子片段可以有效地抑制人肝癌HepG2细胞的生长,使进入S期的细胞明显减少,其作用与下调ski基因和周期相关蛋白的表达有关。从以上结果可见,Ski作为肝癌治疗的一个潜在靶点值得进一步研究。