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目的经过长期的科研及临床研究,我们发现补肾益气方药能够治疗气道等的炎症性疾病。中药经验方剂补肾益气方(淫羊藿、黄芪、生地)和补肾益气清热方(淫羊藿、黄芪、黄芩、生地)是本研究团队在诊疗哮喘、COPD等慢性呼系统炎症性疾病的过程中总结出的有效方剂,它对中医辨证为肾阳虚、肾气虚或肺肾两虚或兼痰热郁肺之侯的COPD和哮喘患者有较好的疗效。我们对补肾组分淫羊藿苷和清热组分黄芩苷的前期实验已证实淫羊藿苷对抑制脂多糖、卵蛋白等诱导的炎症确切有效,黄芩苷对抑制香烟烟雾暴露诱导的炎症确切有效,黄芪甲苷、生地梓醇等也有实验证实对支气管炎、心肌炎、肝炎等炎症反应有良好的抑制作用。但国内外对淫羊藿苷、黄芩苷、黄芪甲苷和生地梓醇在香烟诱导产生的COPD炎症反应中作用如何及影响机制尚未有广泛研究。结合传统医学中淫羊藿、黄芪、黄芩及生地在治疗肺胀、咳嗽、喘证的重要作用以及本团队对补肾益气方和补肾益气清热方的物质基础研究及确切临床疗效的认识,我们通过观察中药补肾组分淫羊藿苷、益气组分黄芪甲苷、清热组分黄芩苷和滋肾组分生地梓醇对香烟烟雾诱导的慢性阻塞性肺疾病(COPD)炎症反应的作用,探索中药有效组、黄芪甲苷、黄芩苷和生地梓醇抑制CS所致的炎症反应的部分分子机制。方法1.建立香烟烟雾(CS)诱导的小鼠COPD炎症反应模型,并采用中药组分淫羊藿苷、黄芪甲苷、黄芩苷、生地梓醇和补肾益气组分方(淫羊藿苷、黄芪甲苷和生地梓醇合方)进行干预。随机将小鼠分为18组,每组10只,分别是正常对照组、COPD模型组、COPD+地塞米松组(1mg/kg)组、COPD+淫羊藿苷高、中、低剂量组(100、50、25mg/kg)、COPD+黄芪甲苷高、中、低剂量组(40、20、10mg/kg)、COPD+黄芩苷高、中、低剂量组(100、50、25mg/kg)、COPD+生地梓醇高、中、低剂量组(20、10、5mg/kg)、 COPD+(淫羊藿苷+黄芪甲苷+生地梓醇)高、中、低剂量组。采用连续香烟烟雾暴露法建立小鼠COPD模型；测定小鼠实验开始前和实验结束时的体重；采用WBP全身体积描计仪检测各组小鼠肺功能；采用H&E染色制成病理切片在光学显微镜下观察各组小鼠肺组织结构、炎症细胞浸润、病理学评分、平均内衬间隔(MLI)、肺泡破坏指数(DI)；采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清及肺泡灌洗液(BALF)中IL-8、TNF-α、MMP-9的水平；采用免疫组织化学染色检测各组小鼠肺组织组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)和糖皮质激素受体(GR)表达；采用Western blot法检测各组小鼠肺组织HDAC2蛋白及磷酸化的HDAC2蛋白、GR蛋白和NF-κBP65蛋白、磷酸化的P65蛋白及IκB-α蛋白表达；采用HDAC2活性检测试剂盒检测各组小鼠肺组织HDAC2活性变化。2.建立香烟提取液(CSE)干预A549细胞诱导的炎症反应模型,并采用中药组分淫羊藿苷、黄芪甲苷、黄芩苷和生地梓醇进行干预。观察几种中药对CSE诱导的A549细胞炎症反应的作用时,细胞分组为：Control, CSE, CSE+淫羊藿苷(1、10、50μM),CSE+黄芪甲苷(1、10、50μM),CSE+黄芩苷(1、10、50μM),CSE+生地梓醇(1、10、50μM)、CSE+地塞米松(1μM)。采用CCK-8试剂盒检测药物对细胞的增殖与毒性作用；采用ELISA检测细胞培养上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的水平；采用Western blot法检测细胞HDAC2蛋白、GR蛋白和NF-κBP65蛋白表达；采用HDAC2活性检测试剂盒检测细胞HDAC2活性变化；采用real-time PCR检测细胞HDAC2mRNA和GR mRNA表达。结果1.香烟烟雾暴露可明显减轻小鼠体重,损伤小鼠肺功能从而降低小鼠PEF、PIF及MV,导致小鼠肺组织炎症细胞浸润、肺组织结构改变及肺气肿发生,并能显著升高小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α和MMP-9水平,损伤小鼠肺组织HDAC2活性及蛋白表达,诱导HDAC2磷酸化,降低小鼠肺组织GR蛋白表达,增强P65磷酸化、降低IκB-α表达从而激活NF-κB信号通路(P<0.05)。香烟烟雾提取液刺激A549细胞可诱导类似的炎症反应,导致细胞分泌的IL-6、IL-8和TNF-α水平显著升高,并能降低细胞核HDAC2的活性及蛋白表达,抑制GR mRNA表达,激活NF-κB信号通路(P<0.05)。2.淫羊藿苷体内实验证实能恢复COPD小鼠体重,保护COPD小鼠肺功能从而提高小鼠PEF、PIF及MV,降低MLI和DI从而减轻COPD小鼠肺气肺情况,抑制COPD小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α及MMP-9的水平以及抑制COPD小鼠肺组织炎症细胞浸润,抑制COPD小鼠肺组织NF-κB P65磷酸化和增强IκB-α表达,增强HDAC2活性及蛋白表达并抑制HDAC2磷酸化、促进GR表达(P<0.05)。3.黄芪甲苷体内实验证实能恢复COPD小鼠体重,降低MLI和DI从而减轻香烟烟雾暴露所致的COPD小鼠肺气肿情况,抑制COPD小鼠血清及肺泡灌洗液(BALF)中MMP-9的水平、BALF由TNF-α的水平以及抑制COPD小鼠肺组织炎症细胞浸润,抑制NF-κBP65磷酸化(P<0.05),但对IκB-α蛋白无明显作用(P>0.05)。4.黄芩苷体内实验证实能恢复COPD小鼠体重,保护COPD小鼠肺功能从而提高小鼠PEF、PIF及MV,降低MLI和DI从而减轻COPD小鼠肺气肿情况,抑制COPD小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α及MMP-9的水平以及抑制COPD小鼠肺组织炎症细胞浸润,抑制COPD小鼠肺组织NF-κBP65磷酸化和增强IκB-α表达,增强HDAC2活性及蛋白表达并抑制HDAC2磷酸化(P<0.05)。黄芩苷对COPD小鼠GR蛋白表达无明显作用(P>0.05)。5.生地梓醇体内实验证实能恢复COPD小鼠体重,减轻COPD小鼠肺气肺情况,抑制COPD小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α及MMP-9的水平以及抑制COPD小鼠肺组织炎症细胞浸润,促进COPD小鼠肺组织下调的GR蛋白表达,恢复IκB-α蛋白表达(P<0.05),但对P65磷酸化无明显作用(P>0.05)。6.组分复方(淫羊藿苷、黄芪甲苷和生地梓醇)能保护COPD小鼠肺功能,恢复COPD小鼠体重,抑制COPD小鼠血.清及肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α及MMP-9的水平以及抑制COPD小鼠肺组织炎症细胞浸润(P<0.05)。因此,三药组分复方对CS诱导的炎症反应也有抑制作用。7.地塞米松体内实验证实其干预COPD小鼠3个月后会导致小鼠体重明显减轻,地塞米松干预不仅未能恢复COPD小鼠肺功能,而且还降低了COPD小鼠的肺功能。地塞米松能抑制COPD小鼠血清及BALF中IL-8和TNF-α水平(P<0.05),但未能显著降低COPD小鼠血清及BALF中MMP-9水平(P>0.05),也未能明显减轻COPD小鼠肺组织炎症细胞浸润(P>0.05)。地塞米松能抑制NF-κBP65磷酸化(P<0.05),但对IκB-α蛋白表达的上调作用不十分明显(P>0.05)。地塞米松能恢复CS诱导的HDAC2活性(P<0.05),但是对COPD小鼠肺组织HDAC2蛋白表达上调作用不十分明显(P>0.05)。地塞米松对COPD小鼠肺组织表达GR蛋白的作用,经免疫组化显示地塞米松无明显上调GR表达的作用(P>0.05),经Western blot检测证实可以明显上调GR表达(P<0.05)。8.淫羊藿苷体外实验证实其能抑制CSE刺激的A549细胞释放IL-8和TNF-α,抑制NF-κBP65蛋白表达,增强HDAC2活性及蛋白表达、促进GR mRNA表达(P<0.05)。9.黄芪甲苷体外实验证实能抑制CSE刺激的A549细胞释放IL-8和TNF-α,抑制NF-κBP65表达(P<0.05),可见黄芪甲苷可能是通过P65及磷酸化的途径来抑制CS诱导的NF-κB激活。黄芪甲苷虽能恢复HDAC2活性(P<0.05),且体内实验证实能上调HDAC2蛋白表达(P<0.05),但未在体外实验中得到证实,因此其对HDAC2的影响不明确。10.黄芩苷体外实验证实其能抑制CSE刺激的A549细胞释放IL-8和TNF-α,抑制NF-κBP65表达,增强HDAC2活性及蛋白表达(P<0.05)。11.生地梓醇体外实验证实能抑制CSE刺激的A549细胞释放IL-6、IL-8和TNF-α,促进GR mRNA的表达(P<0.05)。生地梓醇虽能恢复HDAC2活性,且体内实验证实能上调HDAC2蛋白表达(P<0.05),但未在体外实验中得到证实,因此其对HDAC2的影响尚需考察。12.地塞米松体外实验证实其在CSE诱导的A549炎症反应模型中,对细胞释放IL-8的抑制作用不如地塞米松在TNF-α诱导的A549炎症反应模型中对IL-8的抑制作用。地塞米松对CSE干预的A549细胞表达HDAC2蛋白有上调作用(P<0.05),但这一结果未在体内实验中得到证实。结论1.本实验中,香烟烟雾暴露可诱导小鼠发生COPD炎症反应,减轻小鼠体重,降低小鼠肺功能,导致小鼠肺组织炎症细胞浸润及肺气肿发生,并能显著升高小鼠血清及肺泡灌沈液中IL-8、TNF-α和MMP-9水平,损伤小鼠肺组织HDAC2作用及GR表达,激活NF-κB信号通路。香烟烟雾提取液刺激A549细胞可诱导类似的炎症反应,导致细胞分泌的IL-6、IL-8和TNF-α水平显著升高,并能损伤细胞核HDAC2作用及GR表达,激活NF-κB信号通路。因此,HDAC2、GR和NF-κB信号通路均参与了CS诱导的炎症反应,且HDAC2的作用损伤和GR的表达降低可能间接促进了NF-κB活化程度的增强。2.补肾组分淫羊藿苷对香烟烟雾暴露所致的炎症反应有抑制作用,其作用机制可能是通过抑制NF-κB活化、恢复HDAC2的作用以及促进GR表达途径实现的。其抑制NF-κB活化的作用与其抑制NF-κBP65磷酸化及增强IκB-α表达有关；其降低IL-8和TNF-α水平的作用可能与抑制NF-κB活化有关；其改善肺气肿的作用可能与其能抑制MMP-9的水平有关。3.益气组分黄芪甲苷对香烟烟雾暴露所致的炎症反应有部分抑制作用,其作用机制可能是通过抑制NF-κB活化途径实现的。其抑制NF-κB活化的作用与其抑制NF-κBP65磷酸化有关；其降低IL-8和TNF-α水平的作用可能与其抑制NF-κB活化有关；其改善肺气肿的作用可能与其抑制MMP-9的水平有关。4.清热组分黄芩苷对香烟烟雾暴露所致的炎症反应有抑制作用,其作用机制可能是通过抑制NF-κB活化以及恢复HDAC2作用途径实现的。其抑制NF-κB活化的作用与其抑制NF-κBP65磷酸化及增强IκB-α表达有关；其降低IL-8和TNF-α水平的作用可能与抑制NF-κB活化有关；其改善肺气肿的作用可能与其能抑制MMP-9的水平有关。5.滋肾组分生地梓醇对香烟烟雾暴露所致的炎症反应有抑制作用,其作用机制可能是通过抑制NF-κB活化以及促进GR表达途径实现的。其抑制NF-κB活化的作用与其增强IκB-α表达有关；其降低IL-6、IL-8和TNF-α水平的作用可能与抑制NF-κB活化有关；其改善肺气肿的作用可能与其抑制MMP-9的水平有关。6.组分复方(淫羊藿苷、黄芪甲苷和生地梓醇)能保护COPD小鼠肺功能,抑制COPD小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α及MMP-9的水平以及抑制COPD小鼠肺组织炎症细胞浸润。因此,三种中药组分的复方对香烟烟雾暴露诱导的炎症反应也有抑制作用。7.中药组分淫羊藿苷、黄芪甲苷、黄芩苷和生地梓醇以及组分复方(淫羊藿苷、黄芪甲苷和生地梓醇组方)对香烟烟雾暴露诱导的COPD小鼠炎症模型或CSE诱导的A549细胞炎症模型的炎症反应均有不同程度的抑制作用,其中黄芪甲苷拮抗炎症的作用不如淫羊藿苷、黄芩苷和生地梓醇。8.本实验中,地塞米松能部分、但不能完全有效地抑制香烟烟雾暴露诱导的炎症反应,这与国外的研究基本一致。原因之一是香烟烟雾暴露诱导的炎症反应的确存在激素抵抗现象,且可能与地塞米松不能有效恢复香烟烟雾暴露抑制的HDAC2作用以及不能有效促进GR表达有关。另一个原因可能是与本实验采用的地塞米松1mg/kg(小鼠)和1μM(A549细胞)的使用剂量偏低有关。