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第一部分:肾癌源性exosome的提取及鉴定目的:分离纯化肾癌细胞分泌的exosome,检测exosome免疫相关蛋白的组成,探讨其潜在的临床应用价值。方法:体外培养人肾癌细胞株RC-2。用超滤和蔗糖/重水密度梯度超速离心法分离纯化exosome,透射电镜观察其形态,Western blot检测其免疫相关蛋白的组成。免疫细胞化学检测肾癌细胞肾癌特异性抗原G250的表达。结果:用超滤和蔗糖/重水密度梯度超速离心法成功分离出exosome。透射电镜下肾癌源性exosome为类圆碟形,由脂质双分子层包绕的半球体,直径在30～80nm之间。Western blot检测:肾癌源性exosome表达肾癌特异性抗原G250、热休克蛋白70(Heat Shock Protein70,HSP70)和细胞间粘附分子(Intercellular Adhesion Molecule-1,ICAM-1)。免疫细胞化学检测示:人肾癌细胞RC-2高表达肾癌特异性抗原G250。结论:超滤和蔗糖/重水密度梯度超速离心法可以分离纯化肾癌细胞分泌的exosome,exosome表达免疫相关蛋白HSP70、ICAM-1,其负载肾癌特异性抗原G250,具有免疫原性,可用于制备肾癌疫苗。第二部分人白细胞介素12基因与GPI信号肽序列融合基因的真核双表达质粒的构建及鉴定目的:将糖基化磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol,GPI)信号肽序列与人白细胞介素12基因拼接成融合基因,构建该融合基因的真核双表达质粒。方法:将人白细胞介素12(IL-12)的P35亚基基因亚克隆至pBudCE4.1质粒,获得重组质粒pBudCE4.1/IL-12A。将人胎盘碱性磷酸酶-1(hPLAP-1)C末端信号肽序列与IL-12的P40亚基基因进行拼接,将融合基因亚克隆至重组质粒pBudCE4.1/IL-12A,获得重组质粒pBudCE4.1/IL-12A/IL-12B-GPI。酶切及测序鉴定质粒。结果:用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切pBudCE4.1/IL-12A质粒,可切下约762bp的目的条带,测序正确。将重组质粒pBudCE4.1/IL-12A/IL-12B -GPI用KpnⅠ、XhoⅠ、BamHⅠ和XbaⅠ酶切,可切下约762bp和1104两个的目的条带,分别是IL-12A链和IL-12B-GPI。测序结果未发生基因突变,与GenBank的编码序列对比,显示碱基序列正确。。结论:真核双表达质粒pBudCE4.1/IL-12A/IL-12B-GPI的成功构建,为进一步应用IL-12锚定修饰exosome奠定了基础。第三部分IL-12锚定修饰exosome的肾癌疫苗的制备及鉴定?目的:制备IL-12锚定修饰exosome (exosome-GPI-IL-12,EXO/IL-12)的肾癌疫苗及其蛋白组成和功能鉴定。方法:将糖基化磷脂酰肌醇信号肽序列与白介素12基因融合构建真核双表达质粒pBudCE4.1/IL-12A/IL-12B-GPI转染肾癌细胞,获得稳定转染细胞株。激光共聚焦显微镜和磷脂酰特异性磷脂酶C(PI-PLC)洗脱的流式细胞仪检测目的蛋白(GPI-IL-12)在肾癌细胞的表达。用超滤和蔗糖/重水密度梯度离心法从稳定转染细胞株培养上清液中制备疫苗EXO/IL-12。透射电镜鉴定其形态,Western blot鉴定EXO/IL-12的标志性分子HSP70、ICAM-1的组成,以及肾癌特异性抗原G250和目的蛋白GPI-IL-12的表达。ELISA测定EXO/IL-12负载IL-12的量。IFN-γ释放实验和CFSE标记淋巴细胞的增殖实验检测膜结合的IL-12的功能。结果:激光共聚焦显微镜示:稳定转染的肾癌细胞株高表达目的蛋白GPI-IL-12。PI-PLC洗脱的流式细胞仪检测示:IL-12是以锚定蛋白的形式结合在肾癌细胞膜表面。从稳定转染细胞株培养上清液中可以分离纯化出EXO/IL-12疫苗,为类圆碟形、双层膜结构,直径30～80nm,高表达HSP70、ICAM-1、G250和GPI-IL-12。ELISA测定10μg的EXO/IL-12含约80±9.6pg/ml的IL-12。10μg的EXO/IL-12在体外能诱导淋巴细胞分泌IFN-γ的量为174.3±14.6pg/ml ,与exosome的40.7±9.5pg/ml相比,差异显著(P<0.01)。并且,EXO/IL-12在体外能显著诱导淋巴细胞的增殖,其增殖指数为1.45±0.015,与exosome(1.29±0.01)相比,差异显著(P<0.01)。结论:pBudCE4.1/IL-12A/IL-12B-GPI质粒稳定转染肾癌细胞能制备EXO/IL-12疫苗,该疫苗表达GPI-IL-12,负载肾癌特异性抗原G250,能在体外显著诱导T淋巴细胞的增殖及分泌IFN-γ。结果表明:膜结合的IL-12具有生物学功能,经IL-12锚定修饰的exosome,其免疫原性显著提高。第四部分IL-12锚定修饰肾癌源性exosome疫苗在体外抗肿瘤效应的研究目的:探讨EXO/IL-12疫苗在体外诱导淋巴细胞对肾癌细胞的杀伤效应。方法:从健康自愿者外周血中分离培养淋巴细胞和树突状细胞,扫描电镜鉴定树突状细胞的形态。将树突状细胞负载的EXO/IL-12为刺激因子与淋巴细胞体外共培养48小时,刺激活化的淋巴细胞为效应细胞,以CFSE预标记肾癌细胞为靶细胞,按不同的效-靶比加入,共培养48小时后,用CFSE/PI双标的流式细胞仪分析其对肾癌细胞的杀伤效应,以PBS、EXO、IL-12为对照。选择不同的CFSE预标记靶细胞(人肾癌细胞、人膀胱癌细胞和人结肠癌细胞),用CFSE/PI双标的流式细胞仪检测其杀伤率差异,探讨EXO/IL-12诱导淋巴细胞的杀伤效应是否具有抗原特异性。结果:结果显示:在效-靶比为50:1时, IL-12诱导活化的淋巴细胞对肾癌细胞的杀伤率为10.34±3.92%,高于用PBS组的0.7±0.26%(P<0.05);EXO组诱导活化的T淋巴细胞对肾癌细胞的杀伤率为24.3±3.8%,明显高于IL-12组和PBS组,差异显著(P<0.01)。EXO/IL-12诱导的淋巴细胞对靶细胞的杀伤作用最强,杀伤率达53.7±3.9%,与各组比较,差异显著(P<0.01)。并且,EXO/IL-12活化的淋巴细胞对肾癌细胞RC-2的杀伤率明显高于对膀胱癌细胞T-24和结肠癌细胞SW480(杀伤率分别为9.8±2.5%和10.8±2.1%),差异有显著性意义(P<0.01)结论:EXO/IL-12疫苗能在体外诱导淋巴细胞产生较强的抗原特异性细胞毒作用,可望成为治疗肾癌的新疫苗。