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迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda,Et)属于肠杆菌科爱德华菌属,是一种胞内寄生菌。迟缓爱德华菌溶血相关基因(Ethaemolysin activator gene,简称eha)是一个重要的转录调控基因,能够调控Et抵抗巨噬细胞内氧化和酸化等杀菌压力,有助于Et在巨噬细胞内的生存。然而,这机制尚未完全阐明。为了检测不同应激环境下的eha基因转录水平。我们首先以Et菌ET-13基因组为模板,扩增eha基因的启动子区域,构建eha基因的启动子探针pMP220-PehaLacZ载体,并将其电击导入eha缺失株,获得pMP220-PehaLaZ-△eha株。然后模拟细菌在巨噬细胞内的生存环境,检测了在不同的氧化及酸性条件下含该载体细菌的β-gal活性,发现对数期细菌在条件pH6.3和0.10%H202LB处理2h转录水平较高,而前者转录水平最高。为了进一步检测eha基因是否存在对自身的调控,比较在pH6.3和0.10%H2O2处理2h对数期pMP220-PehaLacZ-ET13 菌和 pMP220-PehaLacZ-△eha 菌的 β-gal 活性,发现含该载体的野生菌β-gal的活性均明显低于该载体的缺失菌(p<0.05),说明eha基因对于自身表达起负调控作用。选择一个Eha转录水平最高的条件(pH6.3),培养ET-13野生株与eha缺失株,分别提取两细菌的RNA,其纯度高,满足建库要求,送华大公司进行Illurmina HiSeqTM2000转录组测序(RNA-Sequencing),该序列信息已提交至NCBI Sequence Read Achieve数据库(登录号:SRX 1898774),并进行测序质量评估。为了构建Et菌的两个cDNA文库,其mRNA被随机性打断,其随机性评估表明,这两细菌测序不同的长度的clean reads在Et菌ATCC15947参考基因组中分布均匀。利用比对软件SOAPaligner/SOAP2软件,将clean reads与Et菌ATCC15947参考基因组序列进行比对,这两细菌的clean reads中覆盖率在90%以上的基因分别超过92%。我们采用RNA-Sequencing测序比较了这两细菌在酸性条件下的转录本,筛选出147个差异表达基因(|log2 Ratio|≥1),其中113个基因表达水平上调,34个基因表达水平下调。此外,选取15个差异表达基因进行qRT-PCR随机抽样,两者趋势呈强相关,验证RNA-Sequencing数据的准确性。通过对147个基因采用CO数据库进行功能聚类,分成25类,主要涉及细菌加工、定位、代谢、结合、催化、运输、细胞成份;通过对147个差异表达基因进行KEGG Pathway富集分析,有130个基因可以富集到55条路径(Pathway)中,包括与氨基酸、核苷酸、脂质代谢及铁的转运等路径,涉及基因较多的有双组分系统、ABC转运系统、不同环境中的微生物代谢和次级代谢产物等路径。为了进一步寻找Eha直接调控靶点,利用商品化的Flag单抗富集Eha-Flag蛋白,我们首先eha基因的3末端引入了 PCR的Flag标签.构建Eha蛋白融合表达载体pGEX-4T-ehaflag,.然后将该载体电击入eha缺失株中,细菌感染细胞实验的结果表明,Eha-Flag融合蛋白可以恢复eha缺失株在胞内降低生存的能力。我们进一步摸索染色质免疫共沉淀超声的条件,利用商品化的Flag单抗免疫沉淀Eha-DNA片段,除去结合的蛋白并纯化DNA片段。并根据RNA-sequencing得到的差异表达基因设计引物,通过荧光定量PCR鉴定ChIP富集到Eha的结合靶点,最终筛选出10个Eha直接调控靶基因,包括3个氨基酸代谢相关的基因,1个rRNA修饰相关基因,.1个镰刀菌酸抗性基因,1个编码热休克蛋白IbpB的基因,1个编码鞭毛钩蛋白柏基因,1个柠檬酸代谢相关基因,1个厌氧C4二羧酸转运蛋白及一个未知功能基因。本研究通过寻找全局转录调控因子Eha直接调控的靶基因,揭示Eha转录因子的功能,有助于了解Et菌转录调控机制的特点,进一步完善该菌的调控网络。