目的骨髓来源的抑制细胞(MDSCs)是重要的免疫调节细胞群体,其对T细胞介导的免疫反应具有显著的抑制作用。它们除了在癌症发展过程中具有负向调节作用外,还对移植和自身免疫具有很强的调节作用。CD11b+Gr1+髓源抑制细胞能够使小鼠和人类产生同种异体移植物耐受已有广泛报道。然而,MDSCs的诱导因子,详细表型和功能分子等在各种移植模型中显著不同。它们在慢性移植排斥中的治疗作用尚不明确。本实验试图通过建立脂多糖(LPS)诱导小鼠脓毒血症的模型,采用免疫组化、流式细胞术、免疫磁珠分选等方法分离MDSCs,确定其细胞数量,并检测其细胞表型以及细胞功能。通过尾静脉注射的方法将MDSCs过继转移给同种异体角膜移植受体小鼠体内,观察角膜移植术后移植片的存活情况,从而探讨MDSCs在角膜移植中的作用。方法1.将6-8周雄性C57BL/6(H-2b)小鼠,随机分为对照组(PBS组)和实验组(LPS处理组),每组各5只。实验重复2次。2.5mg/kg LPS腹腔内注射给C57BL/6小鼠,每日一次,共7天。对照组采用同样方法给予腹腔内注射相同剂量的PBS。每日观察生命体征,绘制生命曲线,7天后处死小鼠。2.制备小鼠脾脏、骨髓及外周血单细胞悬液,取50ul上述各组单细胞悬液于流式管中,加入FITC-CD11b抗体,PE-CY5-Gr-1抗体,以FITC、PE/CY5通路圈门MDSCs,流式分析软件分析、成图。将上述制备的各组单细胞悬液离心去上清液后的细胞沉淀中加入0.4ml PBS及0.1ml抗Gr-1生物素,4°C冰箱反应10分钟。离心,弃上清,以2ml PBS重悬,摇匀。将单细胞悬液滴入MDSCs免疫磁珠分选柱中,分选出CD11b+Gr-1 MDSCs,用流式细胞学技术检测MDSCs分选纯度。同样的方法进行CD4+T细胞免疫磁珠分选,用流式细胞学技术检测CD4+T细胞分选纯度。3.将分离的CD11b+细胞加入PBS缓冲液调整浓度为1×106/ml,各取100ul分别加入10ul FITC标记的Ly6C、CD40、CD80、CD86、CD273、CD275、TLR2、TLR4、MHC-II抗体,每组抗体均设有同型对照组,室温避光孵育15分钟。加入PBS缓冲液离心洗涤抗体,上流式细胞仪检测。实验数据进行统计学分析。4.分离的CD11b+细胞重新混悬后,加入终末浓度1mg/ml FITC结合的OVA(OVA-FITC),或者相同比例的CD4+T细胞和CD11b+T细胞,然后进行流式细胞仪测定。取LPS腹腔注射7天组小鼠骨髓细胞分选出的CD11b+细胞与CFSE染色后的小鼠脾CD4+T细胞共培养,将T细胞以1×105/孔的密度接种到96孔板中,CD4+T细胞与CD11b+细胞按1:1、1:2、1:4以及1:8比例接种,检测CD11b+细胞对CD4+T淋巴细胞增殖的抑制能力。留出部分CFSE染色的CD4+T细胞不加CD11b+细胞作为阳性对照;每一孔加入1ul鼠抗CD3/28增殖磁珠刺激,将未加CD3/28增殖磁珠刺激的细胞作为阴性对照。流式细胞仪分别检测各个细胞亚群及其不同比例的混合管CD4+T细胞的CFSE荧光强度,以反映其增殖情况;flowjo软件分析,计算抑制率。5.小鼠行同种异体角膜移植,并随机分为实验组和对照组(n=10),在实施穿透角膜移植手术后即刻予小鼠尾静脉注射1×106 LPS诱导小鼠提取的CD11b+Gr1+细胞,对照组注射等量的PBS。每日通过裂隙灯显微镜观察角膜植片情况。观察每组的植片存活率8周以上。根据角膜移植片混浊、水肿、新生血管三项指标进行评分。当植片的评分达到6或6以上,或者植片混浊一项达到3时,即认为发生免疫排斥反应。由2人同时观察计分并取平均值。通过描绘Kaplan-Meier存活曲线记录植片存活率,组间比较采用log-等级分析。结果1.本研究采用适当剂量(2.5mg/kg)LPS腹腔内连续注射的方式,成功复制了脓毒症小鼠的模型。小鼠注射LPS 12小时后,开始出现病态反应,3-4天达死亡高峰,至7天时病死率约为30%。PBS注射组小鼠7天内未见死亡。随后第8天分析测定LPS诱导模型体内CD11b+Gr1+细胞的表达,脾脏、血液和骨髓中CD11b+Gr1+细胞增加。对照组脾脏中CD11b+Gr1+细胞数目增加了2.9%,而LPS诱导小鼠组为15.8%。同样,LPS诱导小鼠骨髓中CD11b+Gr1+细胞由5.4%增加到29.4%;血液中为0.3%增加到9.3%.这些结果表明在脓毒血症小鼠脾脏、血液和骨髓中CD11b+Gr1+细胞明显增加。其在骨髓中的增加幅度最大。2.CD11b+Gr1+细胞的表型:采用流式细胞分析仪检测了不同的细胞表面标志的表达。LPS诱导小鼠产生的CD11b+Gr1+细胞表面的共刺激分子CD80/CD86、CD40、免疫抑制分子PD1L/PD-1以及TLR4的表达与对照组相似,但Ly6C、TLR2以及MHC-Ⅱ的表达明显增强。3.CD11b+细胞与CD4+T细胞和OVA共培养的结果表明超过98%CD11b+细胞6小时后与可溶性Ag OVA结合,而67%和72%的CD4+T细胞在12小时和24小时后分别产生反应。当CD11b+/T细胞比例为1:2时,CD4+T细胞的增殖抑制达到52%。当二者比例为1:8时,LPS诱导小鼠组的抑制率为30%,而对照组未观察到抑制效果。4.在对实施穿透角膜移植手术后即刻予小鼠尾静脉注射1×106 LPS诱导小鼠提取的CD11b+Gr1+细胞,观察小鼠角膜植片存活情况的同时观察小鼠全身状况。注射小鼠全身均未见明显异常反应,表明LPS诱导的CD11b+细胞过继转移是安全的。CD11b+细胞治疗组的植片存活率明显高于对照组(P=0.02)。CD11b+细胞处理组的平均存活时间为21.4天,而对照组为10.9天。结论实验结果表明LPS诱导后CD11b+Gr1+细胞在脾脏、血液和骨髓显著增加,而且能够抑制活化的CD4+T细胞。骨髓中MDSCs的高表达TLR2表明内毒素感染和非内毒素感染模型之间的表型差异。脂多糖诱导的CD11b+细胞可以发挥抑制性APCs的作用,能够抑制CD4+T细胞的增殖,提高角膜植片的存活率。因而MDSCs参与延迟移植排斥和移植免疫耐受的诱导,预测其将来可用于临床细胞转移治疗移植排斥。