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瘤胃是反刍动物营养物质消化代谢的主要场所,其健康与否直接关系动物机体健康与生产性能的发挥。本论文拟系统研究高精料日粮对奶牛瘤胃健康和泌乳性能的影响,研究内容包括以下四方面。1.SARA对瘤胃细菌菌群结构与组成的影响试验选用4头装有瘤胃瘘管的泌乳奶牛,将其随机分为对照组(CON,40%精料)或SARA组(SARA,70%精料),采用2×2交叉试验设计。每试验期第12、17和21天晨饲后0 h采集瘤胃液样品,提取基因组DNA,进行焦磷酸测序。结果显示,SARA组奶牛瘤胃pH低于5.8的持续时间大于5小时,表明SARA模型成功构建。与对照组相比,SARA组奶牛瘤胃乳酸、丙酸、丁酸、戊酸、总VFA和LPS的浓度(P<0.05)显著升高,乙丙比(P<0.05)显著降低。SARA组奶牛瘤胃菌群丰度指数(Chao1和Ace)和多样性指数(Shannon)显著低于(P<0.05)对照组。在门水平上,SARA组瘤胃变形菌门和拟杆菌门的相对丰度显著降低(P<0.05),但厚壁菌门和放线菌门的相对丰度显著增加(P<0.05)。属水平上,与对照组相比,SARA组奶牛瘤胃中普雷沃氏菌属、密螺旋菌属、厌氧支原体属、不动杆菌属、Papillibacter和unclassified Lentisphaerae,and unclassified bacteria的相对丰度显著降低(P<0.05),而瘤胃球菌属、奇异菌属、双歧杆菌和unclassified Clostridiales的相对丰度显著升高(P<0.05)。SARA组奶牛瘤胃内革兰氏阴性菌的比例显著下降,且瘤胃LPS浓度与拟杆菌门细菌拷贝数间存在显著负相关(r =-0.446,P= 0.029)。结果说明,高精料日粮诱发的SARA可导致瘤胃pH下降,VFA累积,LPS浓度升高;瘤胃细菌菌群结构紊乱,瘤胃细菌菌群的多样性降低。2.SARA对奶牛瘤胃代谢产物的影响瘤胃微生物菌群的改变与瘤胃代谢密切相关,本章拟通过研究SARA对奶牛代谢产物的影响,进一步解析SARA对瘤胃健康的影响。试验动物、试验设计与试验日粮同上。选用每试验期第12、17、21天晨饲前瘤胃液样品,进行GC-MS代谢组学检测。试验结果表明,瘤胃液样品中共检测到233种化合物,主要包括有机酸类、脂肪酸类、糖类、氨基酸类、嘌呤类、胺类、糖醇类等物质。统计显示,较对照组相比,SARA组黄嘌呤、次黄嘌呤、尿嘧啶等细菌降解产物含量显著提高(P<0.05);LPS、生物胺、乙醇胺、戊二酸等有毒有害或促炎物质的含量显著提高(P<0.05);丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、谷氨酸、亮氨酸等15种氨基酸的含量显著提高(P<0.05)。对差异代谢物的通路富集分析结果显示,氨酰基tRNA生物合成,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成三条通路发生显著富集(P<0.05)。结果说明,高精料日粮诱发的SARA会导致瘤胃代谢紊乱,瘤胃内有毒或促炎物质含量升高,氨基酸合成增加,异常代谢产物的增加可能会影响奶牛瘤胃和机体健康。3.SARA对瘤胃上皮基因表达的影响与机制研究本试验旨在通过基因芯片技术研究SARA对瘤胃上皮基因表达的影响,并结合体外细胞培养手段揭示瘤胃上皮炎症相关基因对高精料日粮的响应模式及其可能机制。体内试验:试验动物、试验设计与试验日粮同上。于每期第21 d采集对照组和SARA组瘤胃上皮样品,进行基因芯片分析。结果显示,两组间共有245个基因存在差异。对差异基因进行通路富集分析和功能注释后,发现因子受体与其关联通路(cytokine-cytokine receptor pathway)显著富集(P<0.05),通路中IL-1β、IL-2、IL-22、CCL19、CCL8、CX3CR1、CXCL6、INHBE、LEPR、PRL和TNFRSF9的表达量在SARA组奶牛瘤胃上皮中显著上调(P<0.05),而通路中IL-6和IL15RA的表达量显著下调(P<0.05),结果表明,瘤胃上皮可能已发生局部炎症反应。为验证基因芯片结果的准确性,使用qRT-PCR对IL-1β、IL-2和IL-6的mRNA表达量进行了测定。相关性分析显示,瘤胃上皮炎症因子与瘤胃环境因子(pH和LPS)存在关联(P<0.05),为进一步验证这一结果,进行体外细胞培养试验。结果说明,瘤胃上皮细胞IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8的mRNA表达量在LPS处理后显著上调(P<0.05),而低pH值处理显著提高了瘤胃上皮细胞TNF-α的表达量,表明瘤胃环境因子pH和LPS可能在SARA引发瘤胃局部炎症反应过程中起着重要作用。4.SARA对奶牛泌乳性能及原奶细菌菌群的影响本章旨在研究SARA对奶牛泌乳性能及乳中细菌菌群结构和组成的影响。试验动物、试验设计与试验日粮同上。分别于每试验期第17、18和19天采集奶样,并于每试验期第12、17和21天饲喂后0 h和4 h采集尾静脉血,对所采集奶样中的细菌菌群结构和组成以及所采集血样中的相关指标进行分析。结果显示,对照组和SARA组奶牛的干物质采食量(DMI)、产奶量和乳成分无显著差异(P>0.05)。较对照组相比,SARA组奶牛尾静脉血中白细胞、淋巴细胞数量和白蛋白的含量显著升高(P<0.05),而总蛋白、球蛋白、胆固醇和低密度脂蛋白的含量显著降低(P<0.05)。454测序结果显示,原奶中的优势菌群为放线菌门、后壁菌门、变形菌门和拟杆菌门。较对照组相比,SARA组奶牛原奶中乳房炎病原菌,包括Stenotrophomonasmaltophilia、Streptococcus parauberis、Brevundimonas diminuta 等细菌的相对丰度显著提高(P<0.05);同时,SARA组奶牛原奶中嗜冷细菌,包括Pseudomonas、Brevundimonas、Sphingobacterium、Alcaligenes、肠杆菌属和乳杆菌属等的相对丰度也显著提高(P<0.05)。然而,两组奶牛原奶中细菌菌群的丰度和多样性指数(Ace,Chao和Shannon)无显著差异。结果说明,本试验中,SARA虽未显著影响奶牛的泌乳性能,但可能影响奶牛乳腺健康,增加奶牛患乳房炎风险,并可能降低原奶和乳制品的感官质量,缩短液态奶的贮存期限。综上所述,本论文结合组学技术层层渐进、依次揭示了高精料饲喂诱发的SARA导致瘤胃细菌菌群结构改变,群落趋于简单化;代谢紊乱,有毒有害或促炎物质含量升高;瘤胃上皮基因表达发生改变,引发局部瘤胃炎症;原奶中细菌菌群中乳房炎致病菌含量增多,增加奶牛患乳房炎风险。研究结果有助于揭示瘤胃健康与宿主健康的内在关系,为奶牛的健康饲喂提供一定的理论依据。