研究背景第一部分：小剂量荧光素钠对共聚焦显微内镜图像质量及患者肤色的影响内镜检查是目前早期发现和诊断消化道疾病的最有效方法。现阶段先进的内镜设备如放大内镜、色素内镜和窄带成像内镜在提高消化道早癌的诊断和检出效能方面已有突飞猛进的进展。放大内镜与染色内镜结合后通过对病变部位黏膜表层细胞结构细微改变的识别来提高活检的准确率。然而,上述内镜检查方法均局限于对消化道黏膜表层细胞形态学改变的观察,最终诊断仍然依靠病理组织学活检。探头式共聚焦激光显微内镜(probe-based confocal laser endomicroscopy, pCLE)是近年来内镜技术的新发展,该内镜将共聚焦激光显微镜与传统内镜相结合,在荧光素钠的作用下,可以在普通白光内镜检查的同时,对观察部位的消化道黏膜进行单点逐层深入扫描,通过图像同步处理系统成像,实时观测消化道黏膜表层及粘膜下250μm的横断面结构形态,可获得放大1000倍的高分辨率荧光图像,从而使消化内镜实现了“光学活检”,该技术的应用明显提高了消化道黏膜病变的诊断准确率,也减少了盲目活检的数量。绝大多数的消化道黏膜病变如常见的凹陷型和隆起型病变,能够通过普通白光内镜检查被发现,但是平坦型病变在传统内镜下常呈隐匿表现,极易被误诊或漏诊。共聚焦激光显微内镜(CLE)实现了实时“光学活检”的可能,能够对消化道粘膜病变进行实时在体的组织病理学活检,极大的提高了各种消化道病变,特别是隐匿型病变的检出率。pCLE这种新型内镜在观察消化道黏膜显微结构实行靶向活检时,需要通过组织内强烈的荧光基团实现成像,因此需要在内镜检查的同时静脉注射或在黏膜表面喷洒荧光物质作为显影对比剂。由于荧光素钠使用简便,荧光特性优越,无致畸作用,价格低廉,并发症少见使得其成为共聚焦显微内镜中最常用的显影剂,且在眼科手术中已应用数十年。静脉应用荧光素钠的传统剂量为10%荧光素钠5-10ml,该剂量可保证获得高质量的清晰图像,但患者的皮肤及尿液黄染均非常明显。荧光素钠的半衰期为24小时,虽然通过大量饮水荧光素钠可逐渐代谢,黄染逐渐消退,但该表现仍严重的影响了被检查者的日常生活及工作。我们在预实验中发现很多情况下应用小于传统剂量的荧光素钠时亦可获得清晰的共聚焦内镜图像,例如10%荧光素钠2ml、lml,甚至0.5ml有时亦可看清楚组织结构。第二部分小剂量荧光素钠在胃肠上皮化生诊断中的作用胃癌发病率较高,是世界排名第二的消化道恶性肿瘤,死亡率为男性16.3/10万,女性7.9/10万。中国属胃癌高发国家,一般认为胃癌的发生是一个与遗传因素、环境因素及幽门螺杆菌的感染有关的多步骤、多因素演变的过程。胃癌的发展演变包括以下几个过程：慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎(Atrophic Gastritis, AG)、胃粘膜肠上皮化生(gastric intestinal metaplasia, GIM)、不典型增生(atypical hyperplasia),高级别上皮内瘤变(high-grade intraepithelial neoplasia, HGIN),最终发展为胃癌,其中萎缩性胃炎、肠上皮化生和不典型增生被称为癌前病变。胃黏膜肠上皮化生(GIM)是指在病理情况下,胃粘膜上皮和(或)腺上皮被类似肠粘膜上皮和(或)腺上皮所代替。胃黏膜肠上皮化生是发生肠型胃癌的高危因素之一,被公认为癌前病变,也称为癌前期状态。其病变的程度与胃粘膜细胞的异型增生频率及胃黏膜萎缩的程度相关,若能早期发现并诊断GIM,使其病变得到及时治疗甚至逆转,则可使胃癌得到更早、更有效的治疗。共聚焦激光显微内镜在早期诊断胃癌和GIM方面优势显著,其临床价值已得到证实。细胞癌变在形态学上主要依靠出现异型增生的核分裂像来识别。识别化生的肠上皮,主要依靠其形态学上出现绒毛状胃小凹上皮、潘氏细胞、杯状细胞、吸收细胞或通过粘液染色来识别,正常情况下上述细胞及亚细胞结构只能在显微镜下通过组织病理切片染色后才能观察到,而在普通内镜下不能直接观察到。pCLE可以得到放大1000倍的组织荧光图像,可直接显示上述微型细胞、血管及细胞核等结构。由于病理切片需对病变组织进行固定、脱水等一系列处理,这就使显微镜下观察到的组织与活体组织有明显不同。共聚焦激光显微内镜实现了在体观察及诊断,根据相关研究成果制定的消化道疾病形态学诊断标准,共聚焦显微内镜能够较为准确的诊断和鉴别消化道黏膜是否存在癌变,在消化道肿瘤早期诊疗方面优势极大。第一部分研究中,我们排除了各种严重的黏膜病变的干扰而且所有患者做的是上消化道内镜检查,胃肠道各个脏器由于影响荧光素钠分布和释放的上皮细胞类型、血供、粘膜层厚度及通透性不同,最佳的荧光素钠剂量亦可能不同,我们研究只探讨适用于正常胃窦黏膜的最佳荧光素钠剂量,此较佳剂量是否也适用于胃黏膜肠上皮化生、消化性溃疡、消化道肿瘤、严重的胃炎和胃肠道其他部位诸如下消化道结肠和直肠黏膜将在后续研究中进行。研究目的(1)保证共聚焦显微内镜清晰的图像质量的前提下获得无肉眼可见的皮肤黄染的最佳荧光素钠剂量。(2)将10%荧光素钠0.02ml/kg与传统的荧光素钠剂量0.1ml/kg同时应用于胃肠上皮化生的诊断中,用于比较二者的诊断准确性,从而证明小剂量荧光素钠也适用于胃肠上皮化生的鉴别诊断。研究方法第一部分：小剂量荧光素钠对共聚焦显微内镜图像质量及患者肤色的影响自2015年8月至2015年9月,在山东大学齐鲁医院内镜中心进行胃镜检查的所有符合要求的病人均纳入本研究。检查前20分钟给予1%荧光素钠1ml行皮试检查,对荧光素钠过敏患者不纳入该研究。国际上应用的常规剂量为10%荧光素钠5ml,换算成0.10ml/kg作为本研究分组的上限,选0.01ml/kg作为本实验剂量分组的下限,中间选择0.05ml/kg,0.02ml/kg两个剂量组。根据EXCEL产生的随机数字表将患者随机分为4组并给予相应剂量的荧光素钠。2位具有丰富消化内镜操作及诊断经验的医师(于涛、顾晓萌)参与了本课题中探头式荧光共聚焦激光显微内镜(pCLE)的操作过程。操作医师对患者的荧光素钠剂量分组情况均不知情,所有内镜操作过程由一名助理进行监督并记录。选取胃镜下正常胃窦大弯中线距幽门3-4cm处为观察点,一旦没有严重疾病的胃窦清晰暴露后,助手根据病人不同分组情况迅速静脉注入不同剂量的荧光素钠,分别录制1分钟、5分钟、10分钟、15分钟及20分钟的共聚焦图像视频。检查者对每位患者所应用的荧光素钠剂量均不知晓。所有pCLE的视频文件均自动储存为.mkt (Cellvizio Viewer格式)。邀请2位具有丰富共聚焦内镜操作经验的医师(左秀丽、李长青)根据组织细胞、血管结构、上皮细胞是否与胞浆清晰可辨来进行主观评价,在主观评价前,对所有的共聚焦图像在不考虑患者分组及荧光素钠的剂量情况下打乱顺序进行随机分布,评分者对每张图片信息及评分者相互之间的评价均不知晓。pCLE图像分为3个等级,差：看不清楚组织细胞结构；中：可以看清组织细胞结构,但图像背景较黑；优：可以清楚的显示组织细胞结构。主观评价者分别按照2/3图像认定为差、中、优而记为1,2,3分。得分越高代表图像越清晰。为了评估观察者间一致性,2周后,将共聚焦内镜图像再次随机打乱顺序,另1位经验丰富的内镜医师(季锐)再次对这些内镜图像进行打分,该内镜医师不知道前次打分中各医师的诊断结果,记录该医师的打分结果。pCLE图像客观评价采用信噪比SNR作为客观评价指标,信噪比是电子工程学的一个参数,定义为图像信号强度与干扰图像的噪声之间的比值,比值高于1：1表明图像信号高于噪声干扰,后期处理图像时所有的图像顺序被打乱,应用matlab2013b软件直接计算出信噪比,这个软件甚至可以对模糊的图像给出客观公正的信噪比数值,每个单独的信噪比值被记录用来计算这个图像的平均信噪比值,以客观真实的反映该图像的清晰程度。为了检测患者静脉应用不同剂量的荧光素钠后皮肤黄染程度的变化,参与本研究的患者分别于检查前和检查后1小时于新生儿科应用经皮黄疸仪(NJ33-wuhan, China)行黄疸检测。将经皮黄疸仪分别对准患者的前额、眼角及前胸三个部位,仪器显示的数值即为黄疸值。所有的数据储存于固定的文件夹内备后续分析。第二部分小剂量荧光素钠在胃肠上皮化生诊断中的作用自2015年9月至2015年11月,将在山东大学齐鲁医院内镜中心进行胃镜检查的符合要求的所有病人参与本研究。患者随机分为两组,静脉给予传统剂量的荧光素钠(0.10ml/kg,A组)和第一部分研究所得的小剂量荧光素钠(0.02ml/kg, B组)。所有患者均先接受普通高清白光内镜(EPK-i10内镜,Pentax)检查,仔细观察所有上消化道脏器(食管、胃、十二指肠)有无病变,若不伴有各种严重疾病,助手根据病人不同分组情况迅速静脉注入不同剂量的荧光素钠。通过高清白光内镜EPK-i10的活检孔道置入共聚焦显微内镜的微探头,按新悉尼标准观察五个标准部位(距离幽门口3cm处的胃窦大弯、小弯,距离胃角4cm的胃体小弯、胃体大弯中点及胃角)及肉眼可见病变,仔细观察肉眼可见病变及正常黏膜,当共聚焦图像显示视野内存在杯状细胞时即取靶向活检,同时所有的肉眼可见病变均取活检。所取的活检标本立即以10%福尔马林溶液固定,送病理科经石蜡包埋后,将石蜡标本横切和纵切成4μm的组织切片,常规HE染色后将病理切片图像及诊断结果与共聚焦内镜所拍摄的组织图像进行对比。研究结果第一部分：小剂量荧光素钠对共聚焦显微内镜图像质量及患者肤色的影响1.患者的临床特征共有63名患者纳入本研究,31名为男性患者(49.21%),32名为女性患者(50.79%)。所有患者按照EXCEL的随机数字序列表随机分为四组,A组(0.01ml／kg)：17人,B组(0.02ml/kg)：15人,C组(0.05ml/kg):16人,D组(0.10ml/kg)：15人。四组的平均年龄是：A组,52.40岁(95%可信区间,47.31-57.49)；B组,48.94岁(95%可信区间,42.18-55.71)；C组,45.44岁(95%可信区间,39.58-51.29)；D组,48.65岁(95%可信区间,42.16-55.13)。四组患者的年龄无显著性差异(P=0.449)。四组患者间性别差别是：A组,男性52.94%,女性47.06%；B组,男性46.67%,女性53.33%；C组,男性37.5%,女性62.5%；D组,男性60%,女性40%。四组患者的性别无显著性差别(P=0.635)。2.图像质量主观评价63位患者参与本研究共获得了1575张图片,重复测量资料的方差分析显示伴随荧光素钠剂量减少图像质量亦显著降低(P<0.0001)。任意2个相邻剂量组的独立样本检测显示组A(0.01ml/kg)是四组中唯一显著降低图像质量的一组。(组A与组B P=0.00；组B与组C P=0.236；组C与组DP=0.648)。图中我们亦可看出伴随时间的推移组A(0.01ml/kg)图像质量降低的最快,也就是说组A(0.01ml/kg)荧光素钠体内代谢衰减最快。各组观察者间一致性无差别,说明该评价方法的可靠性较好。3.图像质量客观评价伴随荧光素钠剂量的减少图像信噪比数值亦显著降低(P<0.05)。任意2个独立样本间检测显示组C (0.05ml/kg)与组D (0.10ml/kg)之间无显著性差异,而组A(0.01ml/kg)是唯一一个显著降低图像质量的组(组A与组B,P=0.00；组A与组C,P=0.00；组A与组D,P=0.00；组B与组C,P=0.009；组B与组D,P=0.014；组C与组D,P=0.895)。组B(0.02ml/kg)的SNR数值最高,换句话说,按照0.02ml/kg静脉推注10%荧光素钠可获得最清楚的图像。4.给药前后皮肤黄疸值的比较结果显示只有组A (0.01ml/kg)与组B(0.02ml/kg)间无显著性差异(P=0.148),而其他组间P<0.05。组A与组B的平均黄疸值均小于数值2,我们进一步将组A与组B的数值与数值2行t检验,结果显示具有统计学意义P<0.05,因此我们认为按照0.01ml/kg或0.02ml/kg的剂量静脉注射荧光素钠无肉眼可见的皮肤黄染。第二部分小剂量荧光素钠在胃肠上皮化生诊断中的作用最终共有410位患者参与了共聚焦内镜检查,其中249位符合入组标准及排除标准最终参与了本研究(129,A组；120,B组)。所有参与研究的患者全程未发生荧光素钠不良反应和并发症。A、B两组患者在性别和年龄上没有显著差异。组织病理学诊断如下：120位患者检出肠化(63,A组；57,B组),按照每个病人来计算,A、B两组肠化的检出率分别是48.84%(63/129)和47.5%(57/120)(P>0.05)。就单个病变来说,共有318个肉眼可见病变被检查。A组：152个肉眼可见病变中共取得175个靶向活检,最后,63个病人中的109个部位病理组织学诊断为肠化。B组：166个肉眼可见病变中共取得184个活检,最后,57个病人中的117个肉眼可见病变的病理组织学诊断为肠化。因此就单个肉眼可见病变来说,共聚焦激光显微内镜靶向活检可获得较高的胃黏膜肠上皮化生的诊断检出率(71.71%,109/152,A组；70.48%,117/166,B组),诊断的准确率分别是A组：96%(168/175)；B组：95.11%(175/184)。共聚焦激光显微内镜诊断A、B两组的胃黏膜肠上皮化生的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别是96.40%和95.73%,95.31%和94.03%,97.27和96.55%,92.42%和92.65%。A、B两组在共聚焦激光显微内镜诊断胃黏膜肠上皮化生的准确率上无显著差异(P>0.05)。A、B两组的kappa值分别是0.867 (95%CI 0.782-0.952) and0.891 (95%CI 0.811-0.971)。研究结论第一部分：小剂量荧光素钠对共聚焦显微内镜图像质量及患者肤色的影响1.在上消化道共聚焦显微内镜检查中,与传统应用10%荧光素钠5-l0ml相比,按10%荧光素钠0.02ml/kg的剂量静脉给药即可获得清晰的共聚焦显微内镜图像。2.静脉应用10%荧光素钠0.02ml/kg后患者无肉眼可见的皮肤黄染,不影响日常生活及工作。第二部分小剂量荧光素钠在胃肠上皮化生诊断中的作用1.小剂量荧光素钠(10%0.02ml/kg)对胃黏膜肠上皮化生的诊断效能等同于传统剂量荧光素钠(10%0.1ml/kg)。研究意义：探头式共聚焦显微内镜(pCLE)现已广泛应用于胃肠道黏膜疾病的在体实时诊断,但由于常规剂量的荧光素钠应用后患者皮肤及尿液黄染明显,对日常生活有一定影响,本研究发现应用小于常规剂量的荧光素钠同样可获得清晰的共聚焦内镜图像,同时无肉眼可见的皮肤黄染,更适合于共聚焦显微内镜检查,在肠化的诊断准确性中等同于常规剂量的荧光素钠。