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microRNAs(miRNAs)是一类内源性非编码RNA,长约22nt,在转录后水平调控基因的表达,广泛参与调控各个生物学过程,并在睾丸发育和精子生成的过程中发挥重要的调控作用。miR-221/222基因家族成簇分布,且以大的顺反子形式转录,能负性调节靶基因的蛋白表达,参与机体多种重要的生理和病理过程以及细胞信号传导途径。前期研究表明,miR-221/222基因家族是一类广泛存在于真核生物且进化上高度保守的小分子非编码RNA,并在猪睾丸组织发育的各个时期差异表达。本研究综合利用双荧光素酶报告基因检测技术、实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)、流式细胞术、CCK8试剂盒和EdU细胞增殖检测试剂盒研究了miR-222通过靶向GRB10基因对猪未成熟支持细胞增殖和凋亡的调控作用,研究结果如下:1.采用绝对荧光定量PCR技术检测5个候选编码内参基因(GAPDH、TBP、β-actin、SDHA和B2M)以及5个候选miRNA内参基因(U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR-103)在8个不同发育时期的猪睾丸组织中(E90、D1、D30、D60、D90、D120、D150、DM)的表达稳定性值(M值)发现,5个候选编码内参基因的稳定性依次是:TBP>β-actin>B2M>SDHA>GAPDH;而5个miRNA候选内参中,其稳定性由高至低依次是:U6>ssc-miR-27a>ssc-miR-17-5p>ssc-miR-103>ssc-miR-26a。2.在miRBase数据库中搜索各物种的miR-221/222基因家族成员,利用Ensembl数据库信息确定miR-221/222在基因组中的位置,利用CLustal W软件对miR-221/222基因家族19种典型物种的成熟序列进行多序列比对分析,并利用miRanda、TargetScan、miRWalk等软件预测miR-222的靶基因。结果表明:除少数物种的miR-221/222基因无法定位外,其他物种的miR-221/222基因均位于基因的间隔区,miR-221/222基因同源性较高,在不同的物种间具有高度的保守性,并预测出了miR-222保守性高的一个潜在靶基因GRB10。3.构建psi-CHECK2-GRB10-3′UTR-WT/MUT载体,将载体与miR-222 mimic/Negative control共转染至猪未成熟支持细胞中检测细胞荧光素酶活性,发现miR-222能靶向结合GRB10 3’UTR预测结合位点。在猪未成熟支持细胞中过表达/抑制表达miR-222和干扰靶基因GRB10,分别检测miR-222及靶基因GRB10的表达量,结果显示,过表达/抑制表达miR-222的猪未成熟支持细胞中miR-222表达量极显著高于/低于阴性对照组中表达量(P<0.01);过表达miR-222的猪未成熟支持细胞中GRB10表达量显著低于NC组(P<0.05)、抑制表达miR-222细胞中GRB10表达量极显著高于NC组(P<0.01);干扰靶基因GRB10基因后其表达明显降低。由此可知,miR-222靶向GRB10 3′UTR区预测结合位点,并调控其在猪未成熟支持细胞中的表达。4.通过瞬时转染miR-222 mimic/miR-222 mimic NC和siGRB10/siGRB10 NC后,利用流式细胞周期、CCK-8实验、EdU细胞增殖实验和流式凋亡实验等观察细胞生长、增殖及凋亡的能力变化;并通过三种凋亡相关基因(Bax、Bcl2、Caspase-3)的qRT-PCR检测,确定miR-222和GRB10在猪未成熟支持细胞中的生物学功能。流式细胞周期实验结果表明,过表达miR-222和干扰GRB10均能抑制细胞增殖,促进其凋亡;CCK8实验和EdU细胞增殖实验结果表明,过表达miR-222和干扰预测靶基因GRB10均能抑制细胞的增殖。而流式细胞凋亡实验结果也表明,过表达miR-222或干扰GRB10后,细胞凋亡明显增多。凋亡相关基因的qRT-PCR结果显示,过表达miR-222和干扰GRB10后,与促进凋亡相关的基因Bax和Caspase-3表达量上升,而与抑制凋亡相关的基因Bcl2表达量下降。以上结果都显示,过表达miR-222或干扰GRB10基因均能抑制猪未成熟支持细胞的增殖并促进其凋亡。综上所述,miR-222可能通过靶向GRB10基因抑制猪未成熟支持细胞的增殖并促进其凋亡。