田鼠巴贝斯虫是一种重要的经硬蜱传播的顶复门红细胞专性寄生虫。多感染小型啮齿类动物,也可感染人。健康人感染田鼠巴贝斯虫后往往无明显临床症状,但是免疫功能丧失的个体(如脾脏摘除患者,艾滋病患者)和免疫力低下的人群可能会引发严重感染,继而引起由呼吸窘迫或贫血引起的肾功能衰竭,严重时导致死亡。田鼠巴贝斯虫在感染宿主时通过裂殖生殖进行无性繁殖,裂殖子裂解后会入侵更多的红细胞从而对宿主循环系统造成损害。在这个过程中,田鼠巴贝斯虫会分泌一些抗原,这些抗原使得虫体可以有效地识别宿主红细胞并对其进行黏附、入侵等一系列行为。因此,筛选出裂殖子时期重要的分泌蛋白对于探究田鼠巴贝斯虫入侵和致病机制具有重要意义。而筛选、鉴定分泌抗原的一个重要前提是虫体的体外培养,本课题从建立田鼠巴贝斯虫的体外培养方法入手,通过质谱分析田鼠巴贝斯虫高丰度分泌抗原,并对其中两个进行功能研究。具体如下:1.田鼠巴贝斯虫体外培养方法的建立本研究首先建立了田鼠巴贝斯虫体外培养的方法。对HL-1培养基与1640培养基进行比较,结果表明二者并无明显差异。但是从换液及对血清要求来说使用1640培养基要求新鲜宿主血清,实验小鼠需求量大,而HL-1可使用商品化胎牛血清,故最终确定使用HL-1培养基。2.田鼠巴贝斯虫分泌抗原的筛选使用无血清体系培养田鼠巴贝斯虫,分别收取不同时间段的培养上清进行蛋白质液相色谱质谱分析(LC-MS/MS),结果一共筛选到40种蛋白,通过生物信息学分析,发现两种表达丰度较高的蛋白SA1与GPI10。此两种蛋白为GPI家族蛋白,具有锚定在虫体表面的特点,故选择GPI10与SA1进行研究。3.田鼠巴贝斯虫SA1与GPI10的功能鉴定首先对SA1与GPI10进行截短表达片段的扩增,构建含GST标签的pGEX-6p-1-SA1与pGEX-6p-1-GPI10原核表达载体,转化入BL21与Transetta大肠杆菌后分别进行表达,分别从上清与包涵体得到了纯化后的SA1与GPI10重组蛋白。Western blot分析表明rSA1与rGPI10可以被田鼠巴贝斯虫的BALB/c鼠阳性血清特异性识别,证明其具有很好的反应原性。随后分别进行了鼠源与兔源多克隆抗体的制备,对这两种基因的天然蛋白存在形式进行鉴定,发现SA1与GPI10既存在于虫体裂解物中,也存在于染虫红细胞裂解物中。间接免疫荧光试验表明SA1在田鼠巴贝斯虫裂殖子时期大量表达,且在虫体膜和胞质内均能检测到SA1的荧光信号,在激光扫描共聚焦显微镜下可观察到SA1被大量分泌至胞外;相比之下GPI10胞质内和整体表达量均偏少,且主要分布在虫体膜表面;SA1与GPI10共定位表明,二者在虫体膜上的荧光具有部分重叠,存在部分共定位。红细胞结合试验表明SA1与GPI10的重组蛋白具有黏附红细胞的能力,并且黏附量与蛋白量成正比,表明二者均为离子型黏附;红细胞花环试验结果表明SA1蛋白在HEK293T细胞内表达后会通过其GPI锚结构定位在细胞表面,并且这些SA1蛋白会黏附住宿主红细胞形成明显的花环。由此推测这两种蛋白可能对虫体入侵红细胞起着十分重要的作用;抗体中和试验结果表明SA1与GPI10的多克隆抗体均能抑制虫体生长,抗体浓度分别在0.24 mg/mL和0.2 mg/mL时与对照组差异极显著。综合以上,本研究成功建立了田鼠巴贝斯虫短期连续体外培养方法,通过质谱及生物信息学筛选出SA1与GPI10两种分泌蛋白,通过间接免疫荧光、红细胞结合试验、花环试验及抗体中和试验对二者进行了功能鉴定,对深入探讨田鼠巴贝斯虫入侵宿主的分子机制及对田鼠巴贝斯虫病的免疫预防研究具有重要意义。