结直肠癌至今已成为仅次于肺癌、肝癌和胃癌的全球第四大最致命的癌症，我国平均每35分钟就有一人罹患结直肠癌。资料表明，结直肠癌的发病原因与饮食密不可分，低纤维素、高蛋白和高脂肪为主的饮食习惯导致结直肠癌的发病率直线上升。研究表明，乳酸菌作为应用历史悠久的食品级微生物，具有预防结肠癌和抑制其细胞增殖的作用。胞外多糖作为乳酸菌的重要代谢产物，其抗癌活性和临床应用价值成为近年来的研究热点。　　本研究依据课题组前期对乳酸菌生物活性作用的筛选结果，选择分离自中国少数民族地区传统发酵食品和婴儿粪便中的9株乳酸菌X11、X12、K11、J5、J10、M5、M23、IN4125和SB27为研究对象，以鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus GG，ATCC 53103，USA）标准菌株为阳性对照，分别制备以上乳酸菌的无菌体发酵代谢产物。以HT-29人结肠癌细胞为模型，通过MTT法筛选出K11、M5、SB27 和 X12 菌株的发酵代谢产物对 HT-29 细胞的增殖抑制率分别为20.11 ± 0.36%、25.75 ± 0.63%、35.98 ± 0.47%和21.10 ± 0.98%，显著高于阳性对照组对HT-29细胞的抑制率18.82 ± 1.01%（P<0.05）。经16S rDNA种属鉴定，以上4株乳酸菌均分属于干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）。分别制备提取干酪乳杆菌K11、M5、SB27和X12的粗胞外多糖，通过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析对粗胞外多糖样品进行线性洗脱，得到相应酸性多糖样品。通过苯酚-硫酸法测定K11、M5、SB27和X12干酪乳杆菌所产的粗多糖产量分别为2.16 g/L、2.35 g/L、2.81 g/L和2.09 g/L；纯化后酸性多糖的含量分别为 5.40×10-2 g/L、8.10×10-2 g/L、13.75×10-2 g/L 和 6.6×10-2 g/L。经 DEAE-Sepharose Fast Flow 阴离子交换层析纯化后，得到的 4 株干酪乳酸菌所产酸性胞外多糖中总糖含量与粗多糖相比显著提升，含量均在75%以上。　　通过MTT实验法，以不同作用浓度的K11、M5、SB27和X12干酪乳杆菌所产粗多糖和纯化后酸性多糖为研究对象，对各多糖组分的抑制HT-29细胞增殖能力进行筛选；发现各菌株所产酸性多糖对HT-29细胞的抑制率显著高于粗多糖组分（P<0.05），且抑制率具有浓度依赖性。采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡染色、细胞周期分析、HE和Hoechst 33258染色观察细胞形态以及Caspase-3 蛋白活性检测等凋亡指标，对 K11、M5、SB27 和 X12 干酪乳杆菌所产粗胞外多糖和酸性胞外多糖诱导 HT-29 细胞的凋亡能力进行筛选。结果表明，4 株干酪乳杆菌所产的粗多糖和酸性多糖都可以在一定程度上增加HT-29细胞的凋亡率，并将其细胞周期阻滞在 G0/G1期。但酸性多糖组分的诱导凋亡能力强于粗多糖组分，并对正常细胞Vero毒性作用相对较小，显著低于对HT-29细胞的抑制率（P < 0.05）。其中，L. casei SB27酸性多糖样品能够显著诱导HT-29细胞的凋亡（P<0.05），激活Caspase-3蛋白，并引起癌细胞产生凋亡形态变化。　　通过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析梯度洗脱和 Superdex-200凝胶色谱对L. casei SB27所产酸性多糖组分进一步纯化，得到两个均一组分的胞外多糖样品，LW1和LW2。通过MTT法检测在不同作用时间和浓度条件下LW1和LW2对HT-29细胞的抑制率，结果表明，在作用时间为48 h，LW1组分的抑制率较纯化前提升 28.76 ~ 38.64 %， LW2 组分的抑制率提升 30.55~35.62%。qRT-PCR结果表明，LW1和LW2可以通过激活Caspase-3和Caspase-8基因，上调促凋亡基因Bad和Bax的表达量引起HT-29细胞的凋亡。Western Blot结果显示，LW1干预组的HT-29细胞中Bad、Bax和Caspase-3蛋白的表达水平显著上升（P < 0.05），LW2处理组中Bad和Caspase-3蛋白的表达水平与空白组相比具有显著性差异（P < 0.05）。TEM观察结果显示，LW1和LW2多糖组分可以引起HT-29细胞凋亡形态学的改变。　　采用HPGPC测定LW1和LW2的分子量分别为25.10和12.34 kDa。通过苯酚-硫酸法测定 LW1 和 LW2 的总糖含量，BCA 法测定蛋白含量，间羟基联苯法测定糖醛酸含量以及氯化钡明胶法测定硫酸根含量等指标，确定 LW1 和LW2的总糖含量均高于90%；LW1组分糖醛酸含量为18.16 ± 4.54%，硫酸根含量为1.04 ± 0.65%；LW2组分的糖醛酸含量为30.13± 6.98%，硫酸根含量为0.71± 0.18%；两个组分的蛋白检测结果均呈阴性。通过GC-MS分析单糖组成，结果表明LW1和LW2主要由半乳糖（52.4%和57.4%，mol%）和葡萄糖（29.1%和22.2 %, mol %）组成。FT-IR光谱分析用于定性测定LW1和LW2多糖组分的有机官能团和化学键。采用甲基化分析测定 LW1和 LW2水解产物的糖苷键类型和比例，最终确定 LW1 多糖组分的主要连接方式是以（1→4）-吡喃型半乳糖和（1→4）-吡喃型葡萄糖为主链，（1→4，6）-吡喃型半乳糖为侧链，并通过O-6键连接在主链上。LW2的连接方式可能以（1→4）-吡喃型半乳糖和（1→4）-吡喃型葡萄糖为主链，（1→3）-吡喃型半乳糖通过（1→3，6）-吡喃型半乳糖的O-6键连接在主链上。采用FE-SEM观察LW1和LW2的表面微观形态，两者均呈薄片状具有褶皱而紧密的表面。综上所述，酸性胞外多糖组分LW1和LW2都具有明显的体外抗肿瘤作用，但LW1比LW2的活性更强可能与它们的分子量、单糖组成、功能基团以及糖苷键连接类型的不同有关。