骨髓基质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)可以分化为软骨和骨等骨科相关的组织。骨髓基质干细胞可以作为骨生成细胞的来源,同时也能作为基因治疗的细胞载体,从而在生物领域治疗病患。股骨头缺血性坏死(Osteonecrosis of femoral head,ONFH)是骨科领域具有挑战意义的疾病。在早中期股骨头坏死治疗的临床工作中,保留股骨头的手术需要进一步完善,临床工作中需要可以保留股骨头的新技术。骨生成中成骨细胞出现和成骨能力加强能促进骨质的愈合。骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein-2,BMP-2)是基因领域的新发现,它是促进骨细胞成熟的重要成分,不光能够加强成骨细胞再生、迁移、聚集,而且介导破骨细胞与成骨细胞分化。因此,BMP-2加强成骨能力可能成为骨科疾患临床治疗新方法。然而,直接将BMP-2植入动物机体内有作用时间短,价格贵的特点。怎样能延长作用时间,降低价格呢?BMP-2基因治疗骨缺损,股骨头坏死等很多骨科病患成为国内外探寻方向。本实验采用兔骨髓基质干细胞为细胞模型,解释体内外培养兔骨髓基质干细胞生长特性和成骨潜能,构建rAAV2-hBMP-2(recombinant adeno-associated virus,AAV,重组腺相关病毒)转染兔骨髓基质干细胞复合物,研究其在修复兔股骨头缺血性坏死中效果,为股骨头缺血性坏死组织工程治疗提供实验依据。首先,研究骨髓基质干细胞的一般生物学特性,再将hBMP-2转染至骨髓基质干细胞,观察转染前后的生物学特性及成骨能力。实验方法是麻醉下穿刺获取成年新西兰白兔骨髓,分离培养兔骨髓基质干细胞。倒置显微镜下察看细胞外形和生长状况,钙结节染色、ALP染色测试骨髓基质干细胞成骨能力。制备rAAV2-hBMP-2,以腺相关病毒介导hBMP-2转染兔骨髓基质干细胞,在细胞90%汇合后行病毒转染继续培养,采用Western blot测试转染骨髓基质干细胞中外源hBMP-2基因转录和表达。结果显示原代培养中成纤维细胞样细胞贴壁于培养瓶底,并有少数克隆出现,伴随培养时间加长钙结节逐步增多,细胞间呈现密致圆形不透光团块,经von Kossa染色出现片状棕染,着色区域范围广、面积大;许多ALP染色骨髓基质干细胞呈阳性反应。兔骨髓基质干细胞被hBMP-2基因转染后可表达hBMP-2,这种骨形态发生蛋白在培养上清中分泌蛋白,该种产物能促进兔增加成骨细胞活性和成骨细胞增殖效果。结论是体外培养的兔骨髓基质干细胞是具有成克隆性、自我更新能力的成纤维样细胞;hBMP-2基因转染兔骨髓基质干细胞可表达具有生物活性hBMP-2蛋白,为股骨头坏死生物治疗提供了实验基础。其次,研究hBMP-2转染后骨髓基质干细胞微创治疗股骨头缺血性坏死的的疗效。实验方法是麻醉下穿刺获取成年新西兰白兔骨髓,建立新西兰白兔股骨头缺血性坏死液氮冷冻模型,随机分为3组,共36只,每组12只,依据不同移植物,C组髓芯减压并hBMP-2转染骨髓基质干细胞组;B组是骨髓基质干细胞并髓芯减压组;A组是空白骨坏死对照组。关节镜监视并除去坏死骨之后回植骨髓基质干细胞,手术后的第4,8周对股骨头实施组织学检查。组织形态学检测发现植入4周后,C组有明显成骨,8周时坏死区被彻底修复;B组只有较少新骨出现,8周时坏死区仍多是纤维组织。C组新骨体积显著大于B组。坏死模型生成后8周C组股骨头的关节面没有出现软骨面的塌陷,股骨头的圆球形外形尚规则;B组股骨头存在囊状密度减低区;A组股骨头塌陷。通过关节镜下手术,可以直视坏死部位,彻底清除死骨,从而在股骨头坏死处将骨髓基质干细胞准确植入,进一步增强了股骨头缺血性坏死的修复能力,对股骨头缺血性坏死治疗有一定意义。再次,研究早期股骨头坏死微创治疗,通过骨髓基质干细胞体外培养,达到百万数量级后,探讨在髓芯减压两周以后通过髓芯减压通道回植入股骨头,通过MRI及Harris评分随访,来观察疗效。根据ARCO(Theassociationresearchcirculationosseuse,国际骨循环学会)分期,选取早期股骨头缺血性坏死病例104例。随机将104例患者分2组,其中A组为单纯髓芯减压组,该组患者仅仅对股骨头坏死进行髓芯减压,不做干细胞治疗,患者共51例;B组骨髓基质干细胞结合髓芯减压组,53例。两组均在计算机导航辅助下实施髓芯减压术,同时关节镜监视下实施除去病灶的坏死部位,而B组二期植入体外分离培养获得的骨髓基质干细胞。经平均60个月随访及磁共振检查,B组股骨头坏死体积由29.8%降至10.18%,Harris评分术前55.8分,术后91.3分,临床成功率92.4%,影像学成功率90.1%。在体外通过自体血清培养骨髓基质干细胞体,髓芯减压两周以后回植入股骨头内是一种安全、可靠的方法,对早期股骨头缺血性坏死病人是一种可选择的微创治疗股骨头坏死的保头方法。最后,分析静脉瘀滞不同程度对骨髓基质干细胞髓芯减压治疗股骨头坏死的影响。基于MRI对组织特性很好识别性,探寻股骨头缺血性坏死MRI信号不同表现对疗效的影响,本部分回顾32例(32髋)均保髋治疗的股骨头坏死病例。术前采用核磁和X线片进行评估,分期采用ARCO分期,术前MRI评估:(1)将股骨头骨髓水肿以及关节积液两项评分相加记是瘀积指数;(2)股骨头核磁信号的信号强度分期。评估术后随访X片及MRI以察看疗效。信号强度分期中期效果差;根据MRI评定所指出的重度股骨头瘀滞的患者,骨髓基质干细胞髓芯减压治疗效果差,差异有显著性,从而指出早期股骨头缺血性坏死的髓芯减压干细胞治疗可以用MRI信号来判断预后。本研究通过对骨髓基质干细胞治疗股骨头坏死的基础研究,证实了 hBMP-2转染骨髓基质干细胞对股骨头坏死有更强的成骨效果,通过临床研究说明骨髓基质干细胞结合髓芯减压比单纯的减压临床疗效更好,有望给股骨头坏死患者的治疗带来福音。