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研究背景:PRKAG2心脏综合征家系呈家族遗传性,属常染色体显性遗传;特点是家系成员可出现多种复杂的心脏病变,以心肌肥厚、传导系统异常及心室预激为主要表现。目前国外共报告了17个该病家系的致病基因分析,研究发现与PRKAG2基因突变有关,已经发现的9种突变包括8种错义突变:Arg302Gln、His383Arg、Thr400Asn、Tyr487 His、Asn488Ile、Gln506Lys、Arg531Gly、Ser548Pro及一种移码突变Ins Leu351,他们都集中在PRKAG2的Bateman区域。家系的致病基因分析报道中,PRKAG2基因最常见的突变位点是R302Q,已在9个家系和1名散发患者中检测到该突变。国内洪奎报道的中国人家系存在PRKAG2 R302Q突变,未发现新的突变位点。我科张静博士报道的中国人大家系临床表现有心肌肥厚（56%）、预激综合征（46%）、窦房结功能不良或高度房室传导阻滞、猝死,有的还伴有房颤、房扑等房性心律失常。家系的临床表型符合国外家系报道的共性,对家系成员进行PRKAG2基因测序,在外显子3上发现了一个新的错义突变G100S,这个突变是国内外从来没有报道过的。目前,国外对PRKAG2基因的致病机制研究已经取得了令人瞩目的成绩,国内尚无相关研究报道。早期一些人认为PRKAG2突变引起能量缺乏,另一些人则认为膜电流异常或基因表达异常/心脏发育异常导致了心肌病。然而,随后的研究表明:PRKAG2心脏综合征是一种特殊类型的糖原累积性心肌病。在转基因小鼠模型和人类疾病中贮积的糖类分析证明了这种心肌病中的糖原积累。携带PRKAG2 N488I错义突变的小鼠心脏糖原显著增多。随后,PRKAG2突变改变AMPK活性的研究解释了疾病显性遗传的模式、心脏糖原积累及传导系统中预激的表现型。为了验证PRKAG2 G100S新突变在中国人PRKAG2心脏综合征家系中的致病作用,深入认识PRKAG2 G100S错义突变引起的功能变化,推动PRKAG2基因的致病机制研究,我们通过在CCL13细胞中过表达突变基因,从细胞、分子水平研究了PRKAG2 G100S突变的生物学功能。研究目的:研究基因PRKAG2 G100S新错义突变的功能,探讨该突变在中国人家族性传导系统异常伴心室预激及心肌肥厚家系中的发病机制。研究方法:（1）人PRKAG2全长基因的体外拼接及TA克隆载体的构建:通过商业途径购得PRKAG2基因的一个转录变体cDNA质粒（GenBank登记号BC068598）,其N端缺失了44个氨基酸,根据已知的PRKAG2基因序列（GenBank登记号NM016203）,设计搭桥引物及序列扩增引物,通过PCR搭桥方法,合成完整全长序列的PRKAG2基因,并将其克隆到TA载体,得到的阳性克隆经测序鉴定。（2）携带野生型及突变型PRKAG2基因的重组慢病毒载体构建及鉴定:以PRKAG2基因为模板,利用PCR技术进行定点突变,设计4对引物,将突变位点设计在引物上,通过PCR扩增引物,扩增片段上含有所需要的突变位点,最后将扩增片段GS、RQ及正常PRKAG2基因（WT）克隆到慢病毒穿梭质粒pWPT内,构建表达PRKAG2G100S、PRKAG2 R302Q及野生型PRKAG2基因的慢病毒载体,使用限制性内切酶进行酶切鉴定,并通过序列分析进行确证。（3）携带野生型及突变型PRKAG2基因的重组慢病毒载体的体外实验研究:包装慢病毒并感染CCL13细胞,建立过表达野生型及两种突变型PRKAG2基因的稳转细胞系（CCL13/WT、CCL13/GS、CCL13/RQ）,并以PRKAG2 R302Q为阳性对照,PRKAG2正常基因为阴性对照,末表达外源基因的CCL13细胞为空白对照,分别行FACS检测慢病毒感染情况、Western Blot分析检测PRKAG2表达、免疫荧光检测野生型和突变型PRKAG2基因在细胞中的定位、MTT检测基因突变对细胞增殖的影响、PAS染色检测糖原含量、ELISA方法检测AMPK的活性,从细胞水平初步研究PRKAG2 G100S新突变的功能结果。结果:（1）拼接出全长1707bp的PRKAG2基因,目的基因连接到载体后测序与设计的PRKAG2基因完全一致。（2）在预期位点已经发生突变,904处碱基由A→C,905处碱基由G→A,使PRKAG2基因第302位密码子由精氨酸（R）突变为谷氨酰胺（Q）;298位点发生G→A的突变,使PRKAG2基因第100位密码子由甘氨酸（G）突变为丝氨酸（S）。成功的构建了pWPT-RQ（PRKAG2 R302Q）、pWPT-GS（PRKAG2G100S）、pWPT-WT（PRKAG2）穿梭载体,酶切鉴定及测序结果正确。（3）成功建立了过表达正常或两种突变PRKAG2基因的CCL13细胞模型（CCL13/WT、CCL13/GS、CCL13/RQ）;FACS显示慢病毒成功感染CCL13,各组均有PRKAG2表达。Western Blot分析提示:突变组CCL13/GS、CCL13/RQ与CCL13/WT组相比,PRKAG2蛋白表达量明显减少,表明PRKAG2 G100S、R302Q突变使PRKAG2在CCL13细胞中表达减少;突变组CCL13/GS与CCL13/RQ比较,CCL13/GS组PRKAG2蛋白量稍高于CCL13/RQ组;以上结果提示PRKAG2 G100S、R302Q突变阻碍了基因的正常表达,PRKAG2 G100S突变的阻碍作用弱于PRKAG2 R302Q突变。免疫荧光可以观察到野生型及两种突变型PRKAG2定位于CCL13细胞浆和细胞核中,表明PRKAG2 G100S、PRKAG2 R302Q突变对PRKAG2基因在CCL13细胞中的表达位置没有影响。MTT检测显示在0.5mM AICAR分别作用30分钟、90分钟、24小时后,CCL13/GS组（30min:2.8157±0.0325;90min:2.7223±0.0740;24h:2.5520±0.0110）、CCL13/RQ组（30min:2.8230±0.0251;90min:2.6193±0.0560;24h:2.5467±0.0045）、CCL13/WT组（30min:2.7200±0.0556;90min:2.7010±0.0030;24h:2.5597±0.0071）细胞增殖显著高于空白对照CCL13组（30min:1.4547±0.0032;90min:1.2657±0.0015;24h:1.0253±0.2018）（P＜0.01）,而突变组（CCL13/GS及CCL13/RQ）与表达正常PRKAG2基因组（CCL13/WT）间细胞增殖无明显差异（P＞0.05）。PRKAG2 G100S、PRKAG2 R302Q突变使CCL13细胞浆及胞核内有较多糖原沉积,而未突变组（CCL13/WT、CCL13）糖原沉积较少。加入AMPK激活剂AICAR后,随着加入AICAR浓度的增加,各组内AMPK的浓度随之增加,提示AMPK的浓度与活性是相对应的。而无论是否加入AICAR,突变的CCL13/GS组（加前:13.6240±0.1310;0.5mM AICAR:19.5847±0.4711;2mMAICAR:22.4957±0.9460）及CCL13/RQ组（加前:12.6133±0.1158;0.5mM AICAR:17.3713±0.9644;2mM AICAR:19.3697±0.4264）与非突变的CL13/WT组（加前:25.4903±0.8947;0.5mM AICAR:31.5990±0.6950;2mM AICAR:34.7823±0.2081）及CCL13组（加前:4.9363±1.0655;0.5mM AICAR:6.4203±0.9160;2mM AICAR:7.3463±0.9451）中AMPK的活性有显著差异（P＜0.01）,而两个突变组CCL13/GS、CCL13/RQ之间也有统计学差异（P＜0.05）,表明PRKAG2基因G100S、R302Q突变降低了CCL13细胞中的AMPK活性,而G100S突变降低AMPK活性的作用弱于R302Q突变。结论:（1） PRKAG2 G100S突变导致PRKAG2基因生物学功能发生变化,验证了PRKAG2 G100S突变是中国人PRKAG2心脏综合征家系的发病原因,初步证实了突变导致AMPK活性降低及糖原累积是家系的发病机制。（2）位于PRKAG2基因外显子3上的G100S突变阻碍PRKAG2蛋白表达及降低AMPK活性的作用弱于R302Q突变,提示G100S突变可能使PRKAG2基因Bateman结构域功能发生变化,但对Bateman结构域功能的影响弱于R302Q,由此说明G100S和R302Q对AMPK活性调节的机制可能是一致的,表明中西方的RKAG2心脏综合征患者在发病机制上没有明显的种族差异性。