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膜联蛋白5(annexin5)是annexins家族中分布最广泛、含量最丰富的成员之一,参与很多重要的生理功能,如抗凝血、具有钙离子通道活性、抑制磷脂酶A2及蛋白激酶C的活性等等。
先前的研究表明,annexin5在大鼠睾丸间质细胞(Leydig cell)和支持细胞(Sertolicell)中均有分布。3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)是类固醇激素合成中睾丸所独有的酶,它是鉴定睾丸间质细胞的重要性指标。本实验室先前的研究已经证实,促性腺激素释放激素激动剂(GnRHa)能上调大鼠睾丸间质细胞中annexin5和3β-HSD在mRNA水平和蛋白水平的表达;GnRH刺激体外培养的成年大鼠睾丸间质细胞3 h后,睾酮水平也有明显提高。提示annexin5可能是一种重要的生殖内分泌调控因子,与睾酮之间存在着某种内在联系。
我们重组了具有蛋白活性的大鼠annexin5,来研究外源性的annexin5对睾酮分泌的影响及调控机制。用不同浓度的annexin5处理原代大鼠睾丸间质细胞,结果显示,annexin5终浓度为0.1 nmol/L、1 nmol/L时,实验组睾酮含量显著高于对照组(未加annexin5处理),而终浓度为10 nmol/L时,实验组睾酮的含量虽也有升高,但无统计学意义;用1 nmol/L annexin5处理细胞不同时间,发现6 h和12 h后睾酮分泌量与对照组相比无显著性差异;处理24 h后,睾酮的分泌显著高于对照组,而随着处理时间的延长,作用36 h后,睾酮分泌量又显著下降。接着我们进一步用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(western blotting)方法在mRNNA水平和蛋白水平检测annexin5对类固醇急性调节蛋白(StAR)和睾酮合成相关酶表达的影响,发现与对照组相比,在mRNA水平上,annexin5处理细胞12 h后,只有17β-羟基类固醇脱氢酶X型(17β-HSD10)的表达显著升高,其它均无统计学意义;而处理24h后,StAR、胆固醇侧链裂解酶(P450scc)、3β-HSD和17β-HSD10的表达均有显著升高,而17α-羟化酶(17α-hydroxylase,Cyp17A)表达则无显著差异;在蛋白水平上,annexin5处理细胞12 h后,17β-HSD的表达仍有显著升高,处理24 h后发现,除StAR表达无显著变化外,P450scc、3β-HSD和17β-HSD的表达均有升高。然后我们用无血清培养基培养大鼠睾丸间质细胞2 h后,再用1 nmol/L,annexin5处理不同时间,结果显示:annexin5刺激间质细胞5 min后P-ERK水平开始升高,在10 min时达到峰值,60-min恢复至正常水平。用ERK抑制剂PD98059(50μmol/L)预处理间质细胞20 min后再加入annexin5,发现PD98059完全逆转了annexin5促进睾丸间质细胞睾酮分泌的作用以及对P450scc、3β-HSD和17β-HSD三种蛋白表达的促进作用。
由此我们得出结论:大鼠的annexin5蛋白能剂量和时间依赖性的影响睾酮分泌。ERK1/2 MAPK为调控睾酮分泌过程中的一条重要的信号通路,下游主要是通过在mRNA水平和蛋白水平改变P450scc、3p-HSD和17β-HSD的表达来调控睾酮合成和分泌的。