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自然条件下,植物通过光合器官将吸收光能转化为自身生长发育所需的化学能,但过多的光能会破坏植物的光合系统,造成光合能力下降,出现光抑制,严重时甚至发生光氧化、光破坏。在低温条件下由于光合作用酶活性降低,碳同化能力受限加剧了这种能量不平衡。更多的光能转化为激发能,进而形成活性氧,造成光合系统氧化破坏,同时抑制PSⅡ系统的修复速率。植物在进化过程中形成了众多的保护机制,其中叶黄素循环被认为在抵御光抑制中具有重要意义。玉米黄质环氧化酶是叶黄素循环中的关键酶之一,催化玉米黄质环化成花药黄质进一步形成紫黄质。 西瓜是我国重要的经济作物和夏季消暑果品,具有“瓜中之王”的称号。西瓜原产于非洲,是典型的冷敏感水果,西瓜的栽培地域广泛,但在很大程度上受季节性限制。瓜农为了填补早春西瓜市场的空缺,提高经济效益,经常在早春大棚种植西瓜,但低温弱光影响西瓜产量、品质的问题也日益突出,研究西瓜耐低温弱光,选育抗冷西瓜品种成为日前研究的热点。 本研究从西瓜中扩增得到ClZE基因,利用生物信息学软件进行了序列特性分析及同源性分析,利用Real time PCR技术分析了该基因在根、茎、叶中的表达情况及低温处理前后表达量的变化,利用农杆菌介导转化烟草瞬时荧光表达分析亚细胞定位情况,并利用农杆菌介导法将其正义基因转入拟南芥,并对转基因拟南芥进行功能研究。获得以下主要结果: 1.利用RT-PCR技术从西瓜叶片中获得1998 bp的ClZE ORF阅读框,推测其编码665个氨基酸残基,理论等电点为7.25,不稳定系数为36.94,属于稳定性蛋白,具有一个跨膜结构域。序列分析发现ClZE序列中包含四个保守结构域BlockⅠ-Ⅳ,区域Ⅰ和区域Ⅱ是脂质运载蛋白家族的典型结构域,称为Pyr_redox,区域Ⅲ单加氧酶黄素蛋白区域,区域Ⅳ是FHA区域,在蛋白互作过程中具有重要作用。与蓖麻、葡萄、盐芥、杏、牵牛花、黄瓜的同源性分别为72.4%、72.1%、69.6%、73.4%、71%、94.8%。该结果表明ClZE与其他物种的ZE具有高度的同源性,尤其与黄瓜的同源关系最近。 2.Real time-PCR结果显示ClZE的表达具有组织特异性,主要在叶片中表达,茎中有少量表达,根中几乎检测不到,即ClZE主要在绿色组织中表达。低温弱光处理过程中ClZE的表达量逐渐下降,胁迫12h后表达量最低。成功构建瞬时荧光表达载体GFP-ClZE,利用农杆菌介导转化烟草,培养2-3d后在共聚焦显微镜下观察烟草表皮,以GFP空载体为对照,研究结果表明ClZE定位在叶绿体上。 3.将获得的ClZE基因与含有CaMV35S启动子的pbi121载体连接,成功构建正义表达载体,利用农杆菌介导转化拟南芥,获得4株转基因株系。PCR及半定量PCR结果显示ClZE基因成功插入到拟南芥基因组中,且表达量明显增加。 4.荧光参数检测发现低温弱光胁迫前拟南芥的NPQ值和Fv/Fm值并无明显差异,胁迫处理后,两者的NPQ值的升高和Fv/Fm值的降低开始呈现明显差异,在胁迫处理的前0.5h,相对于野生型拟南芥,转基因株系的NPQ值的升高缓慢。到12h时转基因株系的NPQ低于野生型。恢复期,NPQ值先迅速下降后缓慢恢复到初始值,转基因株系恢复较慢。与NPQ不同,胁迫处理过程中,Fv/Fm逐渐下降,但转基因株系下降较快,在恢复期的前2h,Fv/Fm值迅速上升,然后缓慢恢复,恢复8h后趋于平稳,恢复到初始值。转基因株系的恢复能力相对较低。动态荧光参数的测定结果表明超表达ClZE降低了植株的热耗散能力,PSⅡ反应中心对低温弱光胁迫更敏感。 5.生理指标定量分析在胁迫前植株的H2O2、O2-含量、POD、SOD、APX活性及MDA含量并无明显差异,低温弱光胁迫12h后野生型及转基因株系中活性氧H2O2、O2-含量均明显升高,但转基因株系中H2O2、 O2-含量均显著高于野生型,表明转基因株系中积累了更多的激发能导致活性氧积累增加。抗氧化酶POD、SOD、APX在低温胁迫后均明显升高,转基因株系中POD、SOD活性显著高于野生型,APX活性间差异不明显。该结果表明超表达ClZE导致电子传递受阻,活性氧积累增加。在低温胁迫后MDA含量亦显著升高,且转基因株系中的MDA含量显著高于野生型拟南芥,膜氧化程度更为严重。 综上所述,ClZE在叶绿体中表达,转基因株系ClZE的相对表达量升高,使玉米黄质的积累量减少,降低了植物的热耗散能力,NPQ的下降破坏了叶黄素循环通过热耗散作用对植株的光保护作用,转基因拟南芥对低温弱光的敏感性增强。