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鼠疫杆菌(Yersinia pestis)是腺鼠疫、败血症鼠疫和肺鼠疫的自然疫源性病原,曾经以“瘟疫”的形式给人类的健康造成了极大的危害,历史上共造成约2 亿人死亡,现在世界各地每年仍有鼠疫病例报道。由于生物恐怖袭击事件的发生,已引起世界各国对鼠疫的高度警惕。恐怖袭击常采用气溶胶感染,可直接引起原发性肺鼠疫流行,因而更需要研究安全有效的鼠疫疫苗。传统的鼠疫疫苗包括灭活全菌体死疫苗、减毒活疫苗。虽然灭活全菌体死疫苗在预防腺型鼠疫有一定效果,但对肺型鼠疫无效;减毒活疫苗又具有潜在的毒性。近年来,DNA 疫苗由于能够诱导出较好的体液免疫和细胞免疫而日益受到重视,被誉为疫苗的第三次革命。tPA 信号肽可以促进异种蛋白的分泌表达,增强表达抗原的免疫原性。本文对鼠疫耶尔森氏菌新型DNA 疫苗进行了初步研究,选取鼠疫菌保护性抗原F1、V 蛋白编码基因和人tPA 信号肽为研究对象,PCR 扩增鼠疫菌F1 和V 编码基因,分别与克隆载体pGEM-T 连接后测序,将测序正确的片段与真核表达质粒pVAX1连接,分别构建重组真核表达质粒pVAX1/F1、pVAX1/V 和pVAX1/F1-V,扩增tPA 信号肽,分别插入到F1、V 和F1-V 目的基因的上游,构建分泌型重组真核表达质粒tPA-pVAX1/F1、tPA-pVAX1/V 和tPA-pVAX1/F1-V。重组质粒转染COS-7 细胞,细胞免疫化学方法和Western blot 方法鉴定结果显示重组质粒可表达F1、V 和F1-V 蛋白。在此基础上,重组质粒分别加细胞因子佐剂GM-CSF 免疫BALB/c 小鼠,每组10只,并设PBS 组为阴性对照,100μg/只,双侧股四头肌肌肉注射,隔周免疫一次,加强免疫3 次,检测细胞免疫和体液免疫指标,ELISA 方法检测小鼠血清中总IgG 水平,免疫组显著高于PBS 对照组(P<0.01),在初次免疫后tPA-pVAX1/V 和tPA-pVAX1/F1-V组可以诱导出较高的抗体水平,而其它组要至少二次免疫后才能达到相应水平。抗体亚型分类检测结果显示tPA-pVAX1/V 和tPA-pVAX1/F1-V 组的IgG2a 水平显著提高,说明分泌型tPA-V 和tPA-F1-V DNA疫苗免疫在机体内成功地增强了Th1型细胞免疫为主的免疫应答。ELISPOT 方法检测了特异性活化的可以分泌IFN-γ的CD8+ T 淋巴细胞数,免疫组小鼠形成斑点的细胞数均显著多于PBS 对照组(P<0.01),以tPA-pVAX1/V 和