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为了解牦牛养殖源金黄色葡萄球菌的流行特征,探索抗生素与消毒剂胁迫条件下耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)抗性机制。本文对甘孜州牦牛养殖过程中采样的牦牛鼻拭子和肛拭子进行菌株的分离和初步鉴定,通过聚合酶链式反应扩增16S r DNA和nuc基因,鉴定出金黄色葡萄球菌,对鉴定出的金黄色葡萄球菌进行了肠毒素基因,毒力基因,消毒剂抗性基因,重金属抗性基因的检测。随后从分离株中进一步筛选出MRSA菌株,并对MRSA菌株进行SCCmec分型、MLST分型以及spa分型,检测其携带的耐药基因,并同时检测菌株的耐药表型。利用微量肉汤稀释法测定菌株对消毒剂和抗生素的最小抑菌浓度(MIC),通过亚抑制浓度进行胁迫,并采用荧光定量PCR探索MRSA菌株对抗生素与消毒剂抗性的影响。具体研究内容如下:(1)本研究对甘孜州牦牛养殖过程中牦牛的鼻拭子和肛拭子共采集1281份样品(其中鼻拭子657份,肛拭子624份)。经鉴定有91株为金黄色葡萄球菌,总分离率为7.10%((91/1281)),其中肛拭子的分离率为4.65%(29/624),鼻拭子的分离率为9.44%(62/657)。从甘孜州的18县区采样情况分析金黄色葡萄球菌的污染情况,得出石渠县(25%)、稻城县(18.18%)、巴塘县(18.18%)、德格县(10%)的分离率相对较高。91株金黄色葡萄球菌肠毒素检测中,肠毒素基因selx(51.65%)、set(13.19%)、seo(16.48%)、sen(16.48%)的检出率较高。其他毒力基因hla(51.65%)、hlb(57.14%)、pvl(31.87%)、tsst-1(34.07%)的检出率较高。消毒剂抗性基因检测中,qac A/B为7.69%,qac G为3.30%,qac H无检出,qac C的检出率为35.16%。对细菌进行5种抗重金属基因的检测,其中抗铜重金属基因cop A检出率最高,czr C抗锌重金属基因未检测出,各抗重金属基因的检出率按高到低的排序依次为:cop A(95.60%,78/91)、ars B(94.51%,86/91)、cad D(85.82%,69/91)、ars A(50.55%,46/91)。从菌株的肠毒素基因、毒力基因、消毒剂抗性基因和重金属抗性基因的携带情况看出四川省甘孜州地区牦牛养殖中金黄色葡萄球菌具有潜在的致病性,应引起重视。(2)通过PCR扩增mec A基因,共筛选出24株MRSA菌株,7株MRSA源于肛拭子,17株MRSA源于鼻拭子。利用SCCmec、spa、MLST分型鉴定MRSA,确定10株MRSA为ST59-Ⅳa-t437,4株ST59-III-t437。24株MRSA为多重耐药菌株,分别对2-8种抗生素耐药;携带耐药基因的主要类型为四环素类(teta,tet M)、氨基糖苷类类(aac6’)、大环内酯类(msr A,erm C)、氟喹诺酮类(grl A,nor A);携带seb、sek、seq和selx肠毒素基因;菌株主要携带消毒剂抗性基因qac C,菌株间个别基因存在差异。(3)消毒剂抗性检测中,MRSA对苯扎溴铵的MIC范围为1.22～9.77μg/m L;过氧乙酸的MIC范围在14.65～117.19μg/m L;对次氯酸钠的MIC范围在343.75～2750μg/m L。三种消毒剂中,苯扎溴铵的抑菌效果最佳。在抗生素抗性检测中,MRSA对氨苄青霉素钠的MIC浓度范围在2.5～80μg/m L;苯唑西林钠的MIC为2.5～20μg/m L;头孢西丁的MIC值为10～160μg/m L;氧氟沙星的MIC值为2.5～10μg/m L。4种抗生素都能抑制MRSA细菌,但苯唑西林钠的抑菌效果更佳。(4)菌株在1/4MIC苯唑西林钠、氧氟沙星和苯扎溴铵的条件下胁迫216h后,采用荧光定量PCR检测耐药基因mec A、grl A和消毒剂抗性基因qac G表达水平,并同时检测经过216 h胁迫后,菌株对苯唑西林钠、氧氟沙星、苯扎溴铵抗性表型的变化。结果表明,养殖环节分离菌株MR-YB786(qac G阴性菌株)经1/4 MIC苯唑西林钠胁迫后,苯唑西林钠对其MIC从5.00μg/m L上调至20μg/m L;苯扎溴铵对其MIC从4.88μg/m L下调至2.44μg/m L;经1/4 MIC氧氟沙星胁迫后,氧氟沙星对其MIC值从2.50μg/m L上调至80μg/m L;苯扎溴铵对其MIC从4.88μg/m L下调至2.44μg/m L;经1/4 MIC苯扎溴铵钠胁迫后,苯唑西林钠对其MIC从5.00μg/m L上调至40μg/m L;氧氟沙星对其MIC从2.50μg/m L上调至40μg/m L;苯扎溴铵对其MIC从4.88μg/m L下调至2.44μg/m L。对比屠宰环节分离菌株MR-YS2(qac G阳性菌株)经1/4 MIC苯唑西林钠胁迫后,苯唑西林钠对其MIC从2.50μg/m L上调至10μg/m L;苯扎溴铵对其MIC从0.04μg/m L上调至4.88μg/m L;经1/4 MIC氧氟沙星胁迫后,氧氟沙星对其MIC从20μg/m L上调至40μg/m L;苯扎溴铵对其MIC从0.04μg/m L上调至4.88μg/m L;经1/4 MIC苯扎溴铵钠胁迫后,苯唑西林钠对其MIC从2.50μg/m L上调至40μg/m L;氧氟沙星对其MIC从20μg/m L上调至40μg/m L;苯扎溴铵对其MIC从0.04μg/m L上调至4.88μg/m L。上述分析可知,两株菌株经胁迫后抗性变化有相同也有差异,经亚抑菌浓度抗生素或消毒剂胁迫后,两株菌株对抗生素的抗性都增强了。但无论是在亚水平的抗生素或消毒剂胁迫环境下,qac G阳性菌株MR-YS2对苯扎溴铵的抗性提高,而qac G阴性菌株MR-YB786对苯扎溴铵的抗性下降。(5)结合基因表达情况来看,经1/4MIC苯唑西林钠216 h胁迫后,MR-YS2菌株对苯唑西林钠、苯扎溴铵的抗性提高,但菌株MR-YS2的mec A相对表达量却下降;MR-YB786菌株对苯唑西林钠抗性提高、对苯扎溴铵的抗性降低,菌株MR-YB786 mec A相对表达量开始无明显上升,后期下降至与未胁迫水平相近。经1/4MIC氧氟沙星长时间胁迫后,MR-YS2对氧氟沙星、苯扎溴铵的抗性提高,菌株MR-YS2的基因grl A表达是先上升后下降;而MR-YB786菌株对氧氟沙星抗性提高、对苯扎溴铵的抗性降低,MR-YB786的grl A基因的表达情况与未胁迫前一致。经1/4 MIC苯扎溴铵长时间胁迫后,qac G阳性菌株MR-YS2对苯扎溴铵、苯唑西林,氧氟沙星的抗性提高,同时,菌株MR-YS2的qac G基因表达量在72 h先上升后下降。推测两株菌株在胁迫环境下对苯扎溴铵的抗性表型变化可能与qac G的存在有关。通过抗生素或消毒剂胁迫诱导,菌株对抗生素的抗性都会增强,说明抗生素与QACs消毒剂的长期使用对MRSA菌株抗性增强具有一定的协同效应。综上,本研究通过对牦牛养殖过程中金黄色葡萄球菌分子流行特点进行调查,发现四川省甘孜州地区牦牛养殖过程中金黄色葡萄球菌具有潜在的致病能力,其中,鉴定出24株MRSA菌株均具有多重耐药性,对消毒剂和抗生素的抗性范围较广,对牦牛养殖和加工带来潜在的威胁。并发现苯扎溴铵和苯唑西林钠的消杀效果较好。MRSA在胁迫环境中,基因(mec A、grl A、qac G)表达水平虽有一定差异,但在亚抑制水平的抗生素或消毒剂环境中,都能够同时表现出菌株对抗生素或消毒剂的抗性增强现象。研究结果为牦牛养殖过程中金黄色葡萄球菌的防控提供有效信息,也为消毒剂和抗生素的安全使用提供科学依据。