补阳还五汤出自《医林改错》,由黄芪,当归尾,赤芍,地龙,川芎,桃仁,红花七种中药组成。有补气、活血、通络等功效,临床广泛用于治疗或预防缺血性脑血管病、冠心病、心肌梗塞及其它血栓栓塞性疾病,是目前治疗中风等血栓性疾病应用频率最高的方剂,目前补阳还五汤的研究大多集中在其抗脑缺血机制的研究上,但其药效物质基础尚不明确。本文为揭示补阳还五汤的药效物质基础,以补阳还五汤水煎液为研究对象,运用中药指纹图谱技术与血清药物化学研究方法相结合,建立该方的体内外指纹图谱,探讨其药效物质基础。目的:1.运用中药指纹图谱技术,建立补阳还五汤水煎液体外指纹图谱;2.运用中药血清药物化学研究方法,建立补阳还五汤水煎液大鼠灌胃后动态血浆图谱和血浆特征指纹图谱;3.通过对血中移行成分的分析和体内外色谱图比较,探讨血浆中药物移行成分,旨在为揭示补阳还五汤药效物质基础提供依据。方法:1.采用高效液相色谱二极管阵列检测器,梯度洗脱方式,色谱柱:C18(4.6mm×250mm,5μm),流动相:乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度洗脱,检测波长为230nm,流速0.8mL·min-1,柱温30℃,建立补阳还五汤体外指纹图谱,并通过比较分析补阳还五汤复方供试品、单味药材供试品和药材阴性供试品图谱,指认归属各药材成分峰。在补阳还五汤水煎液体外指纹图谱中,通过对照品比对,指认出5种有效成分并对其进行含量测定;2.补阳还五汤水煎液灌胃SD大鼠,在0、15、30、45、60、90、120、150、180、240min后,腹腔动脉取血浆,分离及预处理含药血浆,在相同色谱条件下,建立补阳还五汤动态血浆图谱和补阳还五汤血浆指纹图谱。通过比较补阳还五汤水煎液、补阳还五汤水煎液含药血浆、空白血浆HPLC指纹图谱,得到大鼠口服补阳还五汤水煎液后,血浆中的原型成分及代谢产物。结果:1.建立了补阳还五汤水煎液指纹图谱,通过中药指纹图谱相似度评价系统对比确定了27个共有峰,通过峰指认,14个共有峰来源于黄芪;1个来源于当归和川芎;2个峰来源于赤芍;2个来源于红花;1个来源于地龙;1个来源于黄芪和赤芍;4个峰在七种药材中都有表现。2.利用补阳还五汤指纹图谱色谱条件,对方中5种主要成分进行含量测定,羟基红花黄色素a、芍药苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮苷、芒柄花黄素分别在1.528~7.640μg(r1=0.9996)、0.8000~4.000μg(r2=0.9998)、0.05050~0.2525μg(r3=0.9993)、2.830~14.15μg(r4=0.9999)、1.720~8.600μg(r5=0.9999)范围内线性关系良好,平均加样回收率依次为97.57%、99.18%、99.59%、96.22%、95.56%。3.口服补阳还五汤水煎液后,通过体内外谱图对比分析0~240min内在大鼠血浆中发现了30个入血成分,各成分出现的先后顺序及含量存在一定的动态变化。4.口服补阳还五汤水煎液后,在大鼠血浆中发现了30个入血成分,其中10个为血浆固有成分,1个为溶剂峰,19个为药源性成分,其中4个为药材原型成分,15个为代谢产物,其中2个为黄芪代谢产物,1个为桃仁代谢产物。结论:1.本实验建立的色谱条件简单、准确、重复性好,通过相似度评价,10批补阳还五汤水煎液相似度良好,为补阳还五汤的质量评价提供依据。2.所建立的含量测定方法简便可行、重复性好,适用于羟基红花黄色素a、芍药苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮苷和芒柄花黄素的含量测定,并为补阳还五汤水煎液提供合理、可靠的质量控制方法。3.本实验首次建立了补阳还五汤含药血浆动态图谱,并对血中移行成分进行动态追踪,方法学考察结果良好,说明建立的色谱条件具有可行性。大鼠口服补阳还五汤水煎液后,入血成分及移行成分并不是一成不变,随着时间的变化,其发生了量和质的变化。4.本实验首次建立了补阳还五汤含药血浆指纹图谱,计算了5批含药血浆指纹图谱的相似度,结果都在0.8以上,说明建立的色谱条件具有可行性。对血中移行成分进行系统分析,得到补阳还五汤的物质基础为19个药源成分峰,并确定11个血中移行成分共有峰,