研究目的:在全世界范围内,结肠癌(colon cancer,CC)是位列男性第四名致死性恶性肿瘤,是位列女性第三名致死性恶性肿瘤。尽管近些年抗肿瘤治疗已经取得相当大的进展,但是结肠癌依然是最具挑战性的疾病之一。特别是,由于结肠癌是一种具有高侵袭性的肿瘤,这一特性限制了手术切除的应用以及具有一定的耐药性。间充质干细胞是一种多能干细胞,可以自我更新,对于炎症和活跃的肿瘤组织具有很强的靶向性。间充质干细胞可以作为治疗基因的靶向运输工具。但是,目前我们对于间充质干细胞的体内运动情况了解不多。肿瘤坏死因子相关凋亡配体(tumor necrosis factor(TNF)-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)可以表达为II型跨膜蛋白,是肿瘤坏死因子超家族中的新成员。近期研究表明经过修饰可以稳定表达治疗基因的间充质干细胞,可以作为肿瘤坏死因子相关凋亡配体的靶向与呈递的细胞运输工具。这种协同抗肿瘤作用,可以用于联合抗肿瘤治疗。但是,这种联合抗肿瘤治疗方法的临床应用受限于缺乏对表达肿瘤坏死因子相关凋亡配体的间充质干细胞的体内运动情况的有效评估。目前,虽然有几种方法可以检测荧光标记的间充质干细胞在体内运动情况。但是尚没有一种可行的检测方法在细胞学水平对输注到体内的间充质干细胞向肿瘤组织靶向运动效率进行评估。现有的影像学检测方法虽然可以示踪干细胞在体内迁移运动与评估其治疗效果。但是这些检测方法难以有效地区分存活的完整间充质干细胞和死亡的干细胞碎片。除此之外,它们更加难以有效评估干细胞向肿瘤组织靶向运动的效率。共聚焦激光显微内镜(confocal laser endomicroscopy,CLE)是近年来发明的一种新型内镜检测技术,能够实时、有效、无创地在体内显示胃肠道粘膜的组织细胞形态。共聚焦显微内镜的有效放大倍率可达1000倍,使其具有细胞学水平的分辨率。此外,共聚焦激光显微内镜所使用的激光激发波长为488nm,其接收波长约为505-585nm,这一特性与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的光学特性相匹配,为进一步实验研究奠定基础。在这里,我们要证明探头式共聚焦显微内镜可以用于示踪间充质干细胞在体内的运动并评估间充质干细胞表达的肿瘤坏死因子相关凋亡配体对结肠癌的治疗效果。我们研究工作的目的如下所述:(1)提取并鉴定骨髓间充质干细胞。并以骨髓间充质干细胞为运输载体,以肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)基因为治疗基因,构建抗肿瘤的靶向重组治疗间充质干细胞(TRAIL-MSC)。(2)研究使用探头式共聚焦显微内镜在体观察表达肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的骨髓间充质干细胞(TRAIL-MSC)对结肠癌的归巢作用。进一步了解TRAIL-MSC靶向到结肠癌瘤体表面与瘤体内部的具体分布特点。评估TRAIL-MSC对结肠癌的治疗效果。以证实通过共聚焦显微内镜(CLE)在体示踪间充质干细胞的可行性。研究方法:第一部分:提取,鉴定间充质干细胞并构建TRAIL-MSC1.提取并鉴定小鼠骨髓间充质干细胞间充质干细胞来源于三至四周龄Balb/c nu/nu小鼠的骨髓并培养。培养好的所得细胞在适当的条件下鉴定其分化潜力与细胞表面的表型。证实所提取细胞符合小鼠骨髓间充质干细胞定义。2.构建稳定表达TRAIL基因的间充质干细胞按照噬菌体:细胞个数为100:1的比例,用慢病毒将TRAIL基因与EGFP基因导入骨髓间充质干细胞。使这两种基因在间充质干细胞上稳定表达。3.建立小鼠结肠癌荷瘤模型使用含有10%胎牛血清,1%双抗的DMEM高糖培养基培养结肠癌细胞HT-29。选取三至四周龄Balb/c nu/nu小鼠饲养在无特定病原体的环境里,体重在15-20g之间。将2×1066HT29结肠癌细胞用100mlPBS重新悬浮后使用注射器注入小鼠右侧背部。第二部分:体内示踪TRAIL-MSC对结肠癌的靶向运动并评估治疗效果1.小动物整体成像的研究当结肠癌荷瘤小鼠的肿瘤直径达到4-6mm时,将5×106修饰后间充质干细胞用100ml PBS重新悬浮后使用注射器注入小鼠尾静脉。注射后18天内使用小动物整体成像仪在第1天,第3天,第5天,第7天和第10天观察修饰后间充质干细胞在体内迁移情况。2.共聚焦显微内镜成像观察迁移至结肠癌组织周围的修饰间充质干细胞的数量可以通过探头式共聚焦显微内镜观察到,并与结肠癌组织的免疫荧光结果和定量聚合酶链反应结果相互比对。3.TRAIL-MSC抗肿瘤治疗效果评估在接受修饰后间充质干细胞注射后第18天,将小鼠处死。通过间断观察并记录小鼠在这段时间肿瘤体积与质量的变化来评估表达肿瘤坏死因子相关凋亡配体与绿色荧光蛋白的间充质干细胞对结肠癌的治疗效果。研究结果:第一部分:提取,鉴定间充质干细胞并构建TRAIL-MSC1.提取并鉴定小鼠骨髓间充质干细胞间充质干细胞提取自三至四周龄Balb/c nu/nu小鼠的骨髓并培养。培养好的原代干细胞在特定适宜的条件下能成功地被诱导分化为骨组织细胞、脂肪组织细胞和软骨组织细胞。此外,间充质干细胞流式细胞鉴定结果为:表达CD29(+),CD44(+)和CD90(+),不表达CD34(-)和CD45(-)。上述表型符合小鼠骨髓间充质干细胞鉴定标准。2.构建稳定表达TRAIL基因的间充质干细胞通过流式细胞仪检测到使用慢病毒同时转染肿瘤坏死因子相关凋亡配体和绿色荧光蛋白的间充质干细胞转染阳性率是81.6%± 3.1(P<0.05,样本数量=3)。同时,只转染绿色荧光蛋白的间充质干细胞转染阳性率是84.6%士1.0(P<0.05,样本数量=3)。使用荧光显微镜与共聚焦显微内镜在体外观察实验组TRAIL-MSC和对照组为单纯表达绿色荧光蛋白的间充质干细胞(EGFP-MSC)。3.建立小鼠结肠癌荷瘤模型接受结肠癌细胞HT29注射大约2-4周后,荷瘤小鼠会形成直径大约4-6mm大小的瘤体,这表示结肠癌荷瘤小鼠模型造模成功。第二部分:体内示踪TRAIL-MSC对结肠癌的靶向运动并评估治疗效果。1.小动物整体成像的研究在使用荧光成像仪观察到的结果中,我们证实相较于未修饰的间充质干细胞,修饰后的间充质干细胞随着时间的推移,在小鼠体内向肿瘤组织具有明显的迁移趋势。在实验组,大约接受尾静脉注射10天后,TRAIL-MSC靶向迁移到结肠癌组织周围。对照组单纯转染绿色荧光蛋白基因的EGFP-MSC靶向运动趋势与TRAIL-MSC相似。2.共聚焦显微内镜成像观察使用探头式共聚焦显微内镜示踪成像表明,相较于对照组,修饰后的间质干细胞靶向到结肠癌组织周围分布明显。这一结果与结肠癌组织的免疫荧光结果和定量聚合酶链反应结果相互验证一致。在产生抑制结肠癌瘤体生长作用的实验组可以观察到有TRAIL-MSC靶向运动到结肠癌瘤体组织周围。而在未产生肿瘤抑制作用的对照组中均未发现间充质干细胞的荧光信号。3.TRAIL-MSC抗肿瘤治疗效果评估在接受尾静脉注射修饰间充质干细胞靶向到结肠癌组织后,检测到结肠肿瘤表面比结肠肿瘤内部细胞荧光信号更强(P<0.05,样本数量=5)。相较于对照组(接受生理盐水,未修饰间充质干细胞尾静脉注射)小鼠,治疗组小鼠的肿瘤体积与质量均更小(P<0.05,样本数量=5)。研究结论:我们从Balb/c nu/nu小鼠体内提取了原代间充质干细胞并对其进行了分化潜能检测和免疫表型的鉴定。随后我们使用携带有EGFP和TRAIL基因的慢病毒将目的基因转入间充质干细胞内,使其共同稳定表达,构建出重组治疗干细胞(TRAIL-MSC)。共聚焦激光显微内镜作为一种能够在活体内有效示踪间充质干细胞移植后向肿瘤组织靶向运动的新型工具,在基础研究和临床应用中均具有良好的应用前景。这种可在临床应用,有效,无创性的示踪技术能够针对患者个体化的干细胞治疗提供有力支持。研究意义:本研究利用从小鼠骨髓提取的间充质干细胞,把携带有EGFP和TRAIL基因的慢病毒与干细胞共培养,将目的基因转入间充质干细胞内,并使目的基因在干细胞共同稳定表达,构建出重组治疗干细胞(TRAIL-MSC)。此外,本实验首次使用内镜设备对重组治疗干细胞(TRAIL-MSC)进行体内示踪研究,并在细胞学水平上对干细胞在体内的靶向运动分布及对应产生的治疗效果进行评估。与传统的影像学示踪方法相对比,共聚焦激光显微内镜检测技术不会受到死亡干细胞碎片的干扰,能够有效区分活的完整间充质干细胞。这一研究结果表明共聚焦激光显微内镜在活体示踪间充质干细胞对结肠癌瘤体的靶向运动及分布具有明显的优越性。