【摘 要】
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茶氨酸是茶树中一类具有重要生理功能的非蛋白类氨基酸。目前发现天然的L-茶氨酸在茶树和蕈类中,且含量较低。L-茶氨酸在树根中合成,经过运输到芽、叶中并积累含量。L-茶氨酸具有多种药用价值,在机体免疫调节、抗肿瘤、提高抗肿瘤药物活性、抗氧化、降脂、降压、调节脑神经等方面具有重要功能,已成为近年来药品研究热点。本研究中L-茶氨酸的生产方式为生物催化合成,包括酶催化法和发酵法。在本实验中采用一种来自于噬甲
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茶氨酸是茶树中一类具有重要生理功能的非蛋白类氨基酸。目前发现天然的L-茶氨酸在茶树和蕈类中,且含量较低。L-茶氨酸在树根中合成,经过运输到芽、叶中并积累含量。L-茶氨酸具有多种药用价值,在机体免疫调节、抗肿瘤、提高抗肿瘤药物活性、抗氧化、降脂、降压、调节脑神经等方面具有重要功能,已成为近年来药品研究热点。本研究中L-茶氨酸的生产方式为生物催化合成,包括酶催化法和发酵法。在本实验中采用一种来自于噬甲基菌（Methylovorus mays No.9）的γ-谷氨酰甲基酰胺合成酶（γ-glutamylmethylamide synthetase）催化合成L-茶氨酸,与来自类球红细菌（Rhodobacte rsphaeroides）多聚磷酸激酶（polyphosphate kinase）偶联,构建基因工程菌株,以L-谷氨酸钠与盐酸乙胺作为底物,建立了生产L-茶氨酸的方法。主要内容如下:（1）利用基因全合成获得来自于噬甲基菌的γ-谷氨酰甲基酰胺合成酶基因gmas,和获得来源于类球红细菌多聚磷酸激酶基因ppk,并通过基因工程手段将其构建到表达载体p ET-21a（+）上,成功获得重组质粒p ET21a-ppk+gmas;使用E.coli BL21（DE3）作为宿主菌株,构建基因工程菌株BL21/p ET21a-ppk+gmas并通过诱导优化使GMAS与PPK蛋白在宿主菌中高效可溶表达。（2）经过对细胞破碎功率,破碎时间的优化,数据有极显著差异,确认90 W,25min为最佳破碎条件;经过对诱导温度,IPTG浓度及诱导时间的优化,数据有极显著差异,确认28℃,1 mmol/L IPTG及8 h为最佳诱导条件,胞内粗酶的比酶活提高,可溶性表达占总表达量的90%以上;利用纯化后的酶液反应,L-茶氨酸产量达到39.7 g/L,产率达到92.2%,利用纯化后的酶粉反应,L-茶氨酸产量达到38.1 g/L,产率达到88.7%。（3）利用基因工程菌株E.coli BL21/p ET21a-ppk+gmas作为催化剂,进行全细胞转化,对底物摩尔比和湿菌体重量等条件进行了优化,数据有极显著差异,L-茶氨酸产量达到28.7 g/L,产率62%。（4）利用基因工程菌E.coli BL21/p ET21a-ppk+gmas进行发酵,通过流加乙胺与葡萄糖增加L-茶氨酸的产量,L-茶氨酸产量达到40.6 g/L。
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