脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是脊髓由于外力撞击、压迫等直接或间接因素造成的一种严重的神经损伤性疾病。SCI常在脊髓原发性损伤的基础上,继发缺血、水肿、缺氧、炎症反应、钙超载等病理过程,导致运动功能丧失和SCI后相应节段下的感觉异常[1]。运动功能的丧失以及感觉异常,严重的影响了患者的生存质量,并给患者的家庭带来了沉重的经济负担。目前该病发病率呈逐年上升的趋势[2],且针对脊髓损伤尚无十分有效的治疗方法,大部分治疗以对症治疗为主,因此临床上急需可以改善脊髓损伤后病情的发展和预后的新的治疗方法。近年来,干细胞的生物治疗逐渐引起人们的关注,并在再生医学领域的研究和临床治疗中得到广泛的应用。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一类具有自我更新能力和多项分化潜能的成体干细胞,它来源广泛,且具有低免疫原性的特点,是组织工程修复的理想移植物。MSCs作为公认的抗炎症反应屏障,是目前SCI细胞移植治疗的最佳选择。大量的文献报道显示MSCs移植在SCI的治疗中有着积极的效应。研究发现,MSCs不仅可以抑制SCI后损伤局部的炎症反应和细胞凋亡情况,还可以促进损伤处轴突及血管的生成;也有文献发现,MSCs可以减少星形细胞疤痕和组织空洞,促进运动功能恢复,但具体机制尚不清楚。在MSCs的临床应用中,存在着细胞移植后存活率低,疗效不稳定等问题。而MSCs上清中提取的外泌体治疗SCI有很大优势,外泌体在血液、培养基中更加稳定,利于保存,易于质量管理,更加安全、体积小不易堵塞血管,不会诱发或者产生肿瘤,它是纳米级载体,可以有选择地到达炎症部位。外泌体是细胞外小泡的一种,在细胞与细胞间的通讯中起着重要作用,MSCs上清中提取的外泌体治疗SCI是通过基因信息和交换蛋白的方式为解决这些问题提供了新思路,促进细胞间的信息交流。外泌体在自然界中的来源及其分布比较广泛,大多数哺乳动物当中都可以分泌,在各种体液中也存在分布,不同的细胞分泌的外泌体有差异,尤其在发生疾病时,正常细胞分泌的外泌体和病态分泌的外泌体成分差别很大。因此对提高MSCs来源的外泌体治疗效果具有重要意义。肿瘤坏死因子α刺激基因-6(Tumor necrosis factor α stimulated gene 6,TSG-6)编码的分泌性蛋白是一种保护性的炎症反应因子,它通过与透明质酸、硫酸软骨素或蛋白多糖结合,介导炎症细胞迁移、黏附与免疫调节和细胞外基质重塑,进而发挥炎症调控作用[3]。重组TSG-6蛋白已应用于多种疾病模型的研究,并表现出了有效的抗炎作用。最近的研究发现,重组人TSG-6局部应用可减轻多种疾病的炎症反应和病理表现[4]。而TSG-6已被证明可在MSCs中表达,并在MSCs移植治疗一些疾病中,发挥了重要作用[5]。因此,明确TSG-6是否在MSCs来源的外泌体移植治疗中发挥关键作用,并以此为基础对MSCs来源的外泌体进行修饰,提高MSCs来源的外泌体移植治疗SCI的效果,对于临床MSCs来源的外泌体移植治疗SCI,有着指导意义。第一部分 骨髓间充质干细胞来源的外泌体对脊髓损伤的影响目的外泌体(exosomes)是近年来新发现的细胞与细胞相互作用的重要手段。它们是纳米级小囊泡(30-150纳米),内含复杂的RNA和蛋白质,可以通过膜受体和其他方式结合到靶细胞。外泌体参与生物信息的调节;各种细胞在正常和病理条件下都能分泌外泌体。外泌体主要来源于细胞内溶酶体微粒形成的多胞体,通过多胞外膜与细胞膜融合释放到细胞外基质中。大量研究表明,移植的间充质干细胞来源的外泌体具有良好的治疗效果,在神经系统损伤的修复中起着关键作用。在该研究中,分离来自骨髓间充质干细胞(BMSCs)的外泌体并通过尾静脉移植到大鼠SCI模型中。观察移植前后大鼠SCI模型的行为学和组织学变化,初步观察尾静脉注射BMSCs外泌体对SCI的治疗作用。方法1.从大鼠骨髓中原代分离骨髓间充质干细胞(BMSCs);2.采集BMSCs细胞培养上清液。用试剂盒提取外泌体。并利用透射电镜观察外泌体的形态。蛋白质印迹法鉴定外泌体表面标记蛋白;3.将30只大鼠随机分为三组,每组分别10只:假手术组、手术对照组和外泌体组。外泌体组大鼠术后1h静脉注射500μl外泌体,手术对照组大鼠术后1h静脉注射500 μl无菌磷酸盐溶液。4.通过BBB评分法和斜板实验评估术后各组大鼠的运动功能;5.通过Nissl染色、HE染色和LFB染色观察脊髓组织形态。结果1.透射电镜结果显示,上清中提取的外泌体,显示出大量具有圆形或椭圆形形状的囊泡状结构。囊泡周围的膜结构明显。尺寸相对均匀,直径约为40-100nm。2.Western Blot检测结果显示CD9和CD63呈阳性,鉴定提取物,确定其为外泌体。3.各组大鼠术前行为学评分均位于正常水平。术后外泌体组以及手术对照组BBB评分和斜板评分均明显低于假手术组(p<0.05)。外泌体注射7天后,外泌体组的BBB评分以及斜板评分高于手术对照组(p<0.05),且差异具有统计学意义。4.移植后D28结果显示,Nissl染色、HE染色和LFB染色发现假手术组的脊髓形态结构正常,手术对照组大鼠体内Nissl体减少,炎性细胞浸润,髓鞘丢失明显。与手术对照组相比,外泌体组脊髓组织内Nissl体增多,炎性细胞浸润减少,髓质减少,减少了鞘层损耗。结论骨髓间充质干细胞来源的外泌体可以减轻脊髓损伤后的组织损伤程度,促进神经运动功能的恢复。第二部分 骨髓间充质干细胞来源的外泌体治疗脊髓损伤的基因表达谱分析目的本研究中我们制作大鼠脊髓损伤模型后利用转录组测序技术,建立大鼠脊髓损伤及骨髓间充质干细胞来源的外泌体治疗的基因表达谱分析。在转录组测序中,可以通过将读数的数量映射到基因区域来估计基因表达水平,但读数的数量不仅与基因表达水平成正比,而且与基因本身的长度和测序数据的数量成正比。为了使不同基因和不同样品之间的基因表达水平相当,将读数转化为FPKM(每百万映射读数的外显子模型的片段每千克碱基)以标准化基因表达。方法SD大鼠(SPF级),戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,利用美国PSI公司,型号IH-0400撞机仪制作大鼠脊髓损伤的模型,20g的撞击棒,在4.5cm处自由落体撞击T10椎体层面脊髓中央,造模成功的标志性为,大鼠双下肢抽搐,尾巴甩向一侧,出现双下肢的瘫痪。从损伤脊髓中提取总RNA,以脊髓中心为中点,上5mm,下5mm。采用转录组测序技术扫描总RNA,获得脊髓损伤后大鼠差异mRNA表达谱从。大鼠骨髓中原代分离骨髓间充质干细胞(MSCs);采集MSCs细胞培养上清液。用试剂盒提取外泌体。并利用透射电镜观察外泌体的形态。蛋白质印迹法鉴定外泌体表面标记蛋白;将12只大鼠随机分为四组,每组分别3只:假手术组、手术对照组、骨髓间充质干细胞组和外泌体组。外泌体组大鼠术后1 h静脉注射500 μl外泌体,手术对照组术后1h静脉注射500 μl无菌磷酸盐溶液,骨髓间充质干细胞组大鼠术后1 h静脉注射500 μ1骨髓间充质干细胞。并于术后24h,通过透射电镜观察外泌体在脊髓组织中的分布情况;成功建立大鼠脊髓损伤模型,并对提取的总RNA进行质量评价,质量可靠。采用转录组测序技术获得脊髓损伤后大鼠mRNA的差异表达谱。观察差异性表达基因数目,并制作基因聚类分析热图。结果通过差异基因筛选并文献查阅,从中选定TSG-6基因进一步研究,测序结果显示,TSG-6在手术对照组中表达比假手术组显著降低;脊髓损伤大鼠经外泌体治疗后,该基因表达水平较手术对照组增高,低于假手术组。结论TSG-6在手术对照组和假手术之间表达有差异;而且治疗组和手术对照组之间存在差异。通过转录组测序,假手术组、手术对照组、外泌体组和骨髓间充质干细胞组之间存在基因表达水平差异。根据基因表达差异和GO功能分析及KEGG信号通路分析,结合文献阅读,选定TSG-6基因与神经损伤相关。第三部分 TSG-6在骨髓间充质干细胞来源的外泌体治疗脊髓损伤中的关键作用目的本研究通过沉默和高表达MSCs来源的外泌体中的TSG-6基因,并将其外泌体注射给SCI大鼠。观察注射前后大鼠脊髓损伤模型的行为学和组织学变化。确定TSG-6在脊髓损伤治疗中的作用。方法1.从大鼠骨髓中纯化并培养MSCs,慢病毒沉默和高表达MSCs中的TSG-6基因和鉴定,提取外泌体。将75只雄性SD大鼠分为五组,每组分别15只:假手术组,手术对照组,外泌体组,TSG-6沉默组,TSG-6高表达组。术后24h进行大鼠灌注,观察外泌体在脊髓组织中的定位和分布。其他大鼠在术后1,3,7,14和D28测试运动能力和行为的变化。同时在术后D28,通过组织切片染色观察损伤处组织形态的变化。2.术后24h观察外泌体在脊髓损伤处分布。术后D28,通过Nissl染色,HE染色和Luxol fast blue(LFB)染色观察脊髓的形态学变化。3.沉默TSG-6基因,并将其外泌体注射给SCI大鼠,通过BBB评分和术后各时间点的斜板实验评分观察各组神经损伤的恢复情况。4.高表达TSG-6基因,并将其外泌体注射给SCI大鼠,通过BBB评分和术后各时间点的斜板实验评分观察各组神经损伤的恢复情况。结果1.荧光显微镜观察慢病毒转染效果。采用聚合酶链反应(PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测转染效果。结果显示MSCs内TSG-6基因沉默和高表达成功;2.外泌体组和TSG-6高表达组大鼠脊髓损伤后BBB评分和斜板评分均显著高于手术对照组(p<0.05),而TSG-6沉默组与手术对照组相比无显著统计学差异。脊髓损伤后第7天TSG-6高表达组BBB评分以及斜板评分均高于外泌体组(p<0.05)。3.移植后D28结果显示,Nissl染色、HE染色和LFB染色发现假手术组的脊髓形态结构正常,手术对照组和TSG-6沉默组大鼠体内Nissl体减少,炎性细胞浸润,髓鞘丢失明显。与手术对照组相比,外泌体组和TSG-6高表达组脊髓组织内Nissl体增多,炎性细胞浸润减少,髓质减少,减少了鞘层损耗。且TSG-6高表达组优于外泌体组。结论MSCs来源的外泌体可以降低脊髓损伤后组织损伤程度,促进神经运动功能的恢复,为生物移植治疗脊髓损伤提供了新的方向和思路。但是高表达TSG-6的MSCs来源的外泌体显示具有更强的治疗效果,TSG-6在MSCs来源的外泌体治疗脊髓损伤中发挥着重要的作用。