【摘 要】
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苹果（Malus×domestica）作为多年生木本植物,遗传转化效率低,限制了苹果基因功能和分子机制的研究以及分子育种的发展。再生作为遗传转化的关键步骤,在苹果中对其关键基因及机理研究较少。BBM（Baby Boom）属于AP2/ERF转录因子家族,定位在拟南芥种子和胚中,可以促进拟南芥和油菜再生不定芽,且可以通过促进玉米不定芽再生而提高遗传转化效率。体细胞胚可以直接发育成完整植株,所以研究体细
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（2018YFD1000100,2019YFD1000100）
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苹果（Malus×domestica）作为多年生木本植物,遗传转化效率低,限制了苹果基因功能和分子机制的研究以及分子育种的发展。再生作为遗传转化的关键步骤,在苹果中对其关键基因及机理研究较少。BBM（Baby Boom）属于AP2/ERF转录因子家族,定位在拟南芥种子和胚中,可以促进拟南芥和油菜再生不定芽,且可以通过促进玉米不定芽再生而提高遗传转化效率。体细胞胚可以直接发育成完整植株,所以研究体细胞胚再生对木本植物具有重要意义,过表达BBM可以促使拟南芥和油菜自发形成体细胞胚。在苹果中,BBM对不定芽再生的相关功能研究还不完善且缺乏对体细胞胚再生功能的研究。本研究在苹果数据库中搜索到与拟南芥BBM氨基酸序列相似性最高的同源序列MdBBM（MD04G1247700）对苹果进行生物信息学分析并利用农杆菌介导的遗传转化方法得到过表达苹果BBM的转基因材料,对其在遗传转化效率、不定芽再生、生长发育和体细胞胚发生方面的功能展开了研究,具体研究结果如下:1、通过进化树分析,MdBBM与蔷薇科植物桃、欧洲甜樱桃、扁桃和梅花的BBM亲缘关系最近。并且通过多序列比对发现,MdBBM含有特异性基序bbm-1和保守结构域AP2,这暗示MdBBM功能的保守性,对比拟南芥（Arabidopsis thaliala）BBM三级结构预测发现,MdBBM的三级结构更复杂,这说明在苹果中,MdBBM可能进化出更复杂的功能。2、通过启动子顺式作用元件分析发现,MdBBM基因启动子含有光响应、种子特异性调控、Me JA响应等相关元件。通过蛋白互作网络预测发现,MdBBM与分生组织调控相关蛋白WUSCHEL、SCARECROW等存在潜在的互作关系。3、通过qRT-PCR分析发现,MdBBM在子房、根和种子器官中的表达水平较高,以上都表明MdBBM可能在再生过程中发挥重要作用。4、为进一步探究MdBBM的功能,将空表达载体p RI101-AN与过表达载p RI101-MdBBM同时转化苹果离体叶片,发现转化p RI101-MdBBM的再生效率是转化p RI101-AN再生效率的16倍,说明过表达MdBBM可以促进苹果的遗传转化效率。5、转化得到的转基因组培苗继续生长过程中,发现过表达MdBBM苹果组培苗高度是对照的1.6倍,且繁殖苗数是对照的2倍以上,说明过表达MdBBM促进苹果组培苗节间伸长和提高再生效率。拟南芥中异位表达MdBBM促进开花,这说明过表达MdBBM对苹果生长发育产生多效性影响。6、进一步探究过表达MdBBM对再生的影响。过表达MdBBM的离体叶片与对照的芽再生率没有显著差异,而过表达MdBBM离体叶片的根再生率是对照的3.75倍,且只有过表达MdBBM的离体叶片再生出体细胞胚,说明了过表达MdBBM促进不定根的产生和诱导体细胞胚发生。在含2,4-D诱导体细胞胚的过程中,过表达MdBBM促进胚性愈伤的形成,增加体细胞胚的形成数量并且加速体细胞胚形成的进程。通过q RT-PCR分析发现,过表达MdBBM通过提高了胚胎发育相关基因Md LEC2的表达水平促进体细胞胚的发生。综上所述,我们主要发现了过表达MdBBM具有促进遗传转化、不定根再生和体细胞胚发生再生方面的功能,同时发现过表达MdBBM对生长发育的多效影响,这为深入研究调控苹果再生的分子机制奠定了基础,且为借助MdBBM提高苹果转化效率,利用分子手段建立苹果高效率遗传转化体系奠定了理论基础。
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