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背景:p53作为肿瘤抑癌蛋白,直接参与了细胞周期调控、细胞代谢、生长以及细胞凋亡、衰老等不同损伤或应激的反应过程。此过程中p53蛋白具有两个重要的调节蛋白—MDM2和MDMX。其中,MDM2能够通过其C末端的E3连接酶降解p53蛋白。而MDMX蛋白虽然与MDM2的泛素E3连接酶序列同源,但是MDMX对p53蛋白的调节作用是具有唯一性的。通过纯化MDMX蛋白鉴定出的高亲和力分子伴侣—CK1α,可以和MDMX蛋白的中间区域相结合并促进MDMX-p53蛋白之间的相互作用。基于MDMX能够与p53蛋白在细胞核内共定位,并调节p53功能,本文拟探索MDMX对于p53蛋白的非降解性调节机制以及对于p53 DNA结合功能是否具有抑制作用,并在此过程中分子伴侣CK1α是否发挥了其协同作用。方法:1.DNA结合实验:首先将FLAG-MDMX或者CK1α-MDMX与p53复合物转染至H1299肿瘤细胞系内,其次用M2琼脂糖珠子纯化FLAG-MDMX/CK1α-MDMX-p53复合物,然后与含有p53结合位点的DNA片段相孵育,细胞体外证明是否FLAG-MDMX/MDMX-P53复合物与DNA片段相结合。2.应用PONDR方法预测MDMX分子结构内部无序区域并选择酶切位点位置,插入三个不同的抗原表位标签(FLAG,MYC和HA),从而构建MDMXc3新的质粒用于下一步实验。3.蛋白片段释放实验(Proteolytic fragment release,PFR):将MDMXc3细胞过表达于H1299细胞系与GST-p53相孵育,然后用特异性抗体固定裂解的细胞内蛋白,用Pre Scission蛋白酶切除复合物后,如果蛋白片段相结合则被固定在琼脂糖珠子上,而没有结合的蛋白片段则释放到上清液中。应用这种新的实验技术,我们进一步研究了MDMX与p53分子间的相互作用以及CK1α能否协同促进MDMX与p53之间相互作用的分子机制。4.细胞体内实验验证在敲除A549,JEG-3,MCF-7以及U2OS四个肿瘤细胞系内MDMX或者CK1α,应用Western blot以及染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,CHIP)探查MDMX与CK1α能否协同抑制p21蛋白的表达以及p53与目的基因p21启动子的相互结合;进一步在IPTG诱导NARF细胞后稳定表达ARF以及在伽马放射线(IR)的作用下,肿瘤细胞内稳定表达p53蛋白及其目的蛋白p21,应用Western blot以及染色质免疫共沉淀技术检测MDMX或者MDMX-367A是否能够抑制目的蛋白p21;我们创建稳定表达MDMX以及MDMX-367A的U2OS肿瘤细胞系,内源性敲除CK1α后,应用Western blot以及染色质免疫共沉淀技术研究是否CK1α参与了MDMX或者MDMX-367A抑制p53 DNA结合功能的分子机制。结果:1.DNA结合实验表明,CK1α-MDMX-p53三种蛋白复合物能够有效抑制p53蛋白的序列特异性DNA结合活性;MDMX-367A与CK1α相结合后也能够明显抑制p53蛋白与序列特异性DNA相结合,而289位点突变后的MDMX无法被CK1α磷酸化从而不能发挥抑制p53蛋白的DNA结合功能的作用。因此实验说明p53蛋白的DNA结合功能被抑制,需要MDMX和CK1α相互协作,以及CK1α对于MDMX 289位点的磷酸化。2.创建可酶切的MDMXc3质粒用于一种新的实验方法——蛋白片段释放实验,其结果表明在MDMX-p53复合物中,MDMX的p53结合域(N端)与p53 N端初始结合后,MDMX的酸性结构域和RING结构域能够二次结合到p53蛋白上并形成稳定的复合物,而MDMX的RING结构域与p53蛋白的结合强度明显高于其N端之间的相互结合。3.蛋白片段释放实验的结果表明MDMXc3的酸性结构域与RING结构域稳定结合到p53的核心结构域上。并进一步研究位于MDMXc3的酸性结构域上的W200S/W201G突变体发现突变体的酸性结构域与p53蛋白的结合减弱,而RING结构域依然与p53蛋白结合力很强,说明酸性结构域与RING结构域是结合到p53蛋白核心结构域的不同位点上。4.与CK1α-136N-MDMXc3-p53以及CK1α-MDMXc3-289A-p53两种三联复合物的阴性对照结果相比,蛋白片段实验结果说明CK1α能够促进MDMX的酸性结构域与p53蛋白的相互作用,并稳定两种蛋白之间的相互结合。进一步研究发现,MDMX的RING结构域不仅能够增加MDMX与p53蛋白之间相互作用的稳定性,而且可以使得p53蛋白活性失活。5.四种不同肿瘤细胞系体内敲除CK1α或者MDMX,我们发现MDMX或者CK1α缺失后都会增加p53目的蛋白p21的表达以及p53与目的基因p21启动子的结合,但是并不影响p53蛋白的稳定性;NARF细胞被IPTG诱导稳定表达ARF或者经过伽马放射线作用后,肿瘤细胞内部能够稳定p53及其目的蛋白p21的表达,在这个背景下转染野生型MDMX或者突变型MDMX-367A可以进一步抑制p21的表达以及p53与p21基因启动子的结合;我们敲除U2OS稳定表达MDMX或MDMX-367A细胞内源性CK1α之后,发现MDMX与p53之间的结合减弱。在伽马放射线诱导p53目的蛋白p21表达背景下,仍然敲除内源性CK1α,MDMX或MDMX-367A对p21的表达以及与p21基因启动子结合的抑制活性被部分反转,说明MDMX或MDMX-367A抑制p53蛋白活性需要CK1α的参与。结论:这些结果表明除了MDMX和p53的N端之间的经典特异结合以外,蛋白之间相互作用过程中出现了二次结合现象,而这个过程对成熟复合物的形成具有明显的稳定作用。CK1α与MDMX复合物通过进一步稳定MDMX酸性结构域与p53核心结构域的相互作用,从而协同抑制p53蛋白的DNA结合能力。这些结果也揭示了MDMX通过分子间二次结合作用调控p53蛋白功能的分子机制,并表现出多结构域蛋白复合物相互作用的共同特征。