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羊草（Leymus chinese），又名碱草，为禾本科赖草属植物，是我国温带广泛分布的禾草。羊草适应性强，属广生态幅植物，能耐旱、耐寒、耐盐碱、耐湿。虽然不是典型的盐生植物，但它具有一定的耐盐碱性，在土壤盐分总量0.1～0.14％、pH8.3～8.9、碱化度13.5～40.9％的生境上都能正常生长。迅速合成并积累大量小分子化合物来维持细胞的正常功能是植物在受到盐碱或其它环境胁迫时，对外界的一种适应性防御反应。甜菜碱便是这类相溶性小分子有机物中重要的一种。在盐分胁迫下，许多植物特别是黎科和禾本科植物细胞中大量积累甜菜碱，可提高细胞渗透调节能力，稳定细胞内大分子蛋白质和生物膜的结构与功能。在羊草中也已测出有甜菜碱的积累。高等植物中，甜菜碱的合成都是由胆碱起始，经过两步催化反应完成的：催化第一步反应的酶是胆碱单氧化酶（choline monooxygenase，CMO），它是甜菜碱生物合成过程中的限速酶。CMO基因是目前耐盐、耐旱基因工程中研究得较多的基因之一。从禾本科植物水稻、玉米等植物中已经分离出该基因，但在羊草中尚未见报道。本实验以羊草为材料，根据GenBank中己注册的黎科和禾本科植物胆碱单氧化酶基因序列，利用primer5.0在保守区设计兼并引物进行RT-PCR扩增，获得520bp特异条带。将PCR产物目的片段回收，克隆至T-载体，转化DH-5a受体菌，获得重组质粒，重组质粒经酶切和PCR鉴定后进行测序。测序结果经比对后与玉米和水稻同源性最高，证明获得羊草CMO基因cDNA的中间片段；在此基础上进行3’RACE获得3’端序列及5’RACE法获得中间片段上游一段cDNA序列，利用DNAman软件对CMOcDNA的中间片段、3’端序列及中间片段上游一段序列进行重叠序列拼接，扩增已获得的片段cDNA序列全长，命名为：LcCMO。在该cDNA序列开放阅读框（ORF）两端分别设计含有BamHⅠ和EcoRⅠ特异引物PLc-1和PLc-2，用于原核表达载体的构建。已获得的羊草LcCMO序列测序后，全长1283bp，其中包括1029bp的开放阅读框，编码343个氨基酸，分子量为37.73kDa，3’非编码区217bp和多聚腺苷酸尾，用生物信息学软件DNAman进行分析，与玉米的CMO基因同源性最高，在核苷酸和氨基酸水平上的一致性分别为78.77％和86.54％。将与pGEM-T连接的重组质粒及pET30a（+）分别用BamHI和EcoRI酶切，回收后连接，构建表达载体pET30a（+）-LcCMO，转化大肠杆菌BL21（DE3）受体菌。在温度为37℃，IPTG终浓度为1mmol／L，不同时间诱导，经SDS-PAGE电泳分析，结果显示LcCMO在大肠杆菌中诱导表达，表达蛋白质分子量约为37kDa。本实验首次从羊草中分离CMO基因，并在大肠杆菌中进行表达，旨在探讨植物耐盐碱基因表达机理，为进一步筛选出耐盐碱基因，解释羊草抗盐碱的分子机制，植物基因工程改造农作物和快速培育新的耐盐碱植物提供理论依据。