人正常胃粘膜细胞全长cDNA文库的构建及鉴定

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胃癌是我国最常见的消化道肿瘤,其年患病率和死亡率均为世界平均水平的2倍以上。我国的胃癌发病率在各种恶性肿瘤中居首位,其死亡率位居第二位。胃癌自第一例胃大切手术至今已有100多年的历史,从目前来讲,外科手术仍是胃癌治疗的主要手段,经过一个多世纪的的以手术为主的综合治疗的发展胃癌术后生存率已有了很大提高,1期胃癌5年生存率为82%-95%,2期为55%,3期为15-30,4期仅2%,存在的问题在于术后仍有较高的复发转移,术后和新辅助放化疗应用于晚期胃癌,但是效果不明显,且容易产生药物抵抗和明显的毒副作用。   近年来,肿瘤基因诊断和治疗的研究一直是肿瘤研究领域的热点,也已成为肿瘤诊断和治疗的一种新模式。构建cDNA文库,可为发现新基因和研究基因功能打下基础。cDNA不象基因组DNA含有内含子而难以表达,因此可以从cDNA文库中采用酵母双杂交的方法来筛选到所需要的目的基因,并可直接用于该目的基因的表达。因此,构建胃粘膜细胞细胞cDNA文库,并进一步筛选克隆,将有助于了解急慢性胃炎、胃十二指肠溃疡及位的良恶性肿瘤的基因表达谱,筛查与这些疾病的发生特异相关的基因和蛋白,从而为探讨急慢性胃炎、胃十二指肠溃疡及位的良恶性肿瘤发病的分子机理及寻找更好的治疗手段奠定基础。并将为阐明从胃癌早期发展到胃癌终末期的分子发病机理奠定基础。   材料与方法:   用Trizol方法提取人人正常胃粘膜总RNA并用mRNA纯化试剂盒进行mRNA纯化,然后反转录合成单链cDNA,长距离PCR方法合成双链cDNA,PCR产物经蛋白酶K水解、纯化后,用XhoI酶切,将酶切产物进行分级分离,回收0.4kb以上的cDNA组分,并与pGADT7载体连接,连接产物经体外蛋白包装,产生未扩增文库,鉴定文库的滴度和重组效率后,进行文库扩增,随机挑取16个噬菌斑,用载体克隆位点两端的通用引物进行PCR扩增,以检测所构建的cDNA文库的质量。   结果:   构建的人胃粘膜cDNA文库滴度为4.00×106pfu/mL,重组克隆百分比>95%,扩增后文库的滴度测定为9.50×109pfu/mL。16个插入片段长度分布在0.5~2.0kb,平均长度为1.0kb。   结论:   构建的人正常胃粘膜细胞cDNA文库为高效全长的酵母双杂交cDNA文库,符合cDNA文库的要求进一步用酵母双杂交的方法探寻与胃疾病相关的基因。
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