蔬菜灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的一种极为严重的世界性病害。利用分子和基因工程的手段,发掘植物抗灰霉病的相关基因,继而研究其抗病机制,以此培育蔬菜抗病品种,是非常重要和有效的途径。本实验室前期获得了1株对灰葡萄孢敏感的拟南芥突变体,确定了其突变基因为T1N6₂2,通过Real-Time PCR、RT-PCR技术和互补回复试验,明确了T1N6₂2为抗B.cinerea的正调控因子和抗Pst DC3000（Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000）的负调控因子,确定了其通过SA和JA两条信号途径来影响拟南芥的抗病性。本研究通过RT-PCR技术,确定了T1N6₂2在不同组织部位和不同生长时期的表达规律;通过检测T1N6₂2与SA和JA途径关键基因的双突变体接种B.cinerea和Pst DC3000后,SA、JA途径关键基因ICS1、PR1、JAR1及PDF1.2基因的表达情况,确定了T1N6₂2基因与SA和JA信号途径的关系;利用GFP瞬时表达技术,确定了T1N6₂2基因的亚细胞定位;利用GUS染色技术,确定了T1N6₂2基因的组织定位;利用原核表达技术,获得了纯化的T1N6₂2蛋白。研究结果为进一步阐明T1N6₂2基因在拟南芥抗灰霉病中的分子机制及抗病育种奠定了基础。1.利用RT-PCR技术,分析T1N6₂2基因在拟南芥野生型的莲座叶、茎生叶、花、种荚、茎和根中的表达情况。结果发现,拟南芥野生型的莲座叶、茎生叶、花、茎和根中T1N6₂2基因的表达水平比较相近,在花、茎和根的表达水平相对较高,在种荚中的表达水平最低。利用RT-PCR技术,检测生长7 d、14 d、21 d、28 d、35 d的拟南芥野生型中T1N6₂2基因的表达情况。结果发现,拟南芥野生型在生长前3周,T1N6₂2基因的表达水平呈上升趋势,3周后下降,5周时表达水平明显降低。2.将t1n6₂2突变体与SA、JA途径关键基因突变体Nah G、eds5和jar1进行杂交,获得了双突变体t1n6₂2/Nah G、t1n6₂2/eds5和t1n6₂2/jar1。对所获得的双突变体和野生型拟南芥接种灰葡萄孢B.cinerea和Pst DC3000后进行抗病性分析,发现野生型拟南芥表现出典型的抗病反应,双突变体在接种后叶片出现水渍状感病症状;利用RT-PCR技术,检测接种灰葡萄孢的叶片中Bc ACTIN基因的表达情况,发现双突变体中的Bc ACTIN基因表达水平明显高于野生型,表明双突变体对灰葡萄孢的敏感性较野生型明显增强。将Pst DC3000接种于拟南芥野生型和双突变体t1n6₂2/eds5、t1n6₂2/Nah G和t1n6₂2/jar1发现,野生型与双突变体t1n6₂2/eds5、t1n6₂2/Nah G及t1n6₂2/jar1均出现了叶片萎蔫卷曲等感病症状,接种叶片中cfu值测定结果显示双突变体对Pst DC3000的敏感性增强。3.利用RT-PCR技术,检测野生型拟南芥和双突变体t1n6₂2/jar1、t1n6₂2/eds5和t1n6₂2/Nah G接种灰葡萄孢后抗病相关基因JAR1、PDF1.2、ICS1和PR1的表达情况。发现双突变体t1n6₂2/jar1中JAR1基因一直呈下降趋势,JA途径的标记基因PDF1.2在野生型中的表达水平略高于双突变体,但差异不明显,而t1n6₂2/jar1中PDF1.2在48 h略有升高。表明,T1N6₂2基因突变抑制了JA合成相关基因JAR1的表达,从而影响拟南芥对灰葡萄孢的抗性。利用RT-PCR技术,检测野生型拟南芥和双突变体t1n6₂2/jar1、t1n6₂2/eds5和t1n6₂2/Nah G接种Pst DC3000后抗病相关基因JAR1、PDF1.2、ICS1及PR1的表达情况。发现ICS1在双突变体t1n6₂2/eds5体中有所上升,PR1有所上升,但均低于野生型水平;双突变体t1n6₂2/Nah G中ICS1在0.5 h迅速升高,随后逐渐降低,PR1基因在2 h时却出现明显升高,出现了SA积累,但随后出现明显下降,并低于野生型水平,表明T1N6₂2基因作为负调控因子影响植物体SA途径,从而调节抗病防御反应。4.构建了T1N6₂2基因的亚细胞定位载体GFP-T1N6₂2,通过农杆菌转化的方法,将GFP-T1N6₂2载体转化烟草,通过激光共聚焦显微镜观察,确定了T1N6₂2基因定位于细胞质和细胞核。5.构建了T1N6₂2基因的组织定位载体T1N6₂2pro::GUS,通过农杆菌介导的方法转化拟南芥野生型,通过GUS组织化学染色,发现其主要在下胚轴、根、叶片、花药和萼片中均有表达。6.构建了T1N6₂2基因的原核表达载体GST-T1N6₂2,将其转入原核表达菌株BL21种进行体外诱导表达,确定了T1N6₂2蛋白原核表达的最佳条件为IPTG 0.1mmol/L,诱导时间为3 h。通过GST亲和纯化方法,获得了纯化的T1N6₂2蛋白。7.成功构建了T1N6₂2基因融合FLAG标签的表达载体FLAG-T1N6₂2,为后续Ch IP试验奠定了基础。