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利巴韦林是一种广谱抗病毒药物,可由嘌呤核苷磷酸化酶催化核糖-1-磷酸和1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺(TCA)合成。利巴韦林对多种DNA和RNA病毒均具有较好的抑制作用,具有作用位点多、不易产生耐药性、疗效高、毒性低,副作用小等特点,现已用于多种病毒的治疗。根据前期筛选得到的具有较高催化效率的三聚体嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase),使用实验室保存的诱导型表达载体pQE30-pupG和组成型载体pQF-pupG分别转化4株大肠杆菌XL1-Blue、BL21(DE3)、DH5α、K27,获得8株工程菌株。采用全细胞催化合成利巴韦林,E.coliXL1-Blue和BL21都要比DH5α和K27表现出更高的活力。E.coli BL21使用乳糖为诱导剂,比IPTG可以获得更多的菌体,且单位细胞的催化活力相当。乳糖诱导系统操作简单、所需成本低,具有重要的工业化应用价值。用乳糖诱导产生的E.coli BL21细胞30 g/L(湿重)为催化剂,在pH 7.6磷酸盐缓冲液中,添加鸟苷和TCA各100 mmol/L,55℃反应20 h,利巴韦林产量可达17.6 g/L,底物转化率为72.1%。为了获得更高的酶活,本论文构建了诱导型表达载体pET-His-pupG,pET系列载体是大肠杆菌中表达重组蛋白最强大的系统。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得工程菌株。采用全细胞催化合成利巴韦林发现使用乳糖作为诱导剂比IPTG能产生出更多的细胞,且单位细胞的催化能力并没有降低。以乳糖诱导产生的E.coliBL21细胞30g/L(湿重)为催化剂,在pH7.6磷酸盐缓冲液中,鸟苷和TCA各100mmol/L,55℃反应20 h,利巴韦林产量可达19.5 g/L,底物转化率为79.9%。研究发现游离细胞催化合成利巴韦林时,游离细胞容易裂解,难以重复利用。本论文通过将重组菌BL21(pET-His-pupG)固定化后,稳定性大幅提高并能反复使用。选择不同包埋凝胶对重组菌固定化,通过对比确定明胶为最佳包埋剂。通过优化明胶固定化条件,发现最适温度55℃,最佳菌体包埋量为200g/L,固定化细胞使用量20 g/L,反应周期20 h。对于固定化细胞催化合成利巴韦林,在pH 7.6的磷酸盐缓冲液中,底物鸟苷和TCA各100 mmol/L,在最优条件下,连续反应8批次后固定化细胞酶活力基本没有损失,转化率最高可达到83.0%。本文针对利巴韦林转化液的特征,确定了合适的提取纯化工艺。研究了活性炭用量、脱色时间和脱色温度对转化液脱色效果的影响,通过测定脱色率和利巴韦林回收率确定了合适的脱色条件:活性炭用量1%,吸附时间20min,脱色温度60℃。脱色后的转化液经过浓缩、结晶、重结晶等步骤,利巴韦林纯度可达到99.1%,提取过程总收率为45.2%。