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一、实验目的:弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)和形态特征介于弥漫性大B细胞淋巴瘤和Burkitt淋巴瘤之间的不能分类B细胞淋巴瘤(B cell lymphoma,unclassifiable,with features intermediate between diffuse large B-cell lymphoma and Burkitt lymphoma,BCLU)都是侵袭性B细胞淋巴瘤,而其中伴有MYC/BCL2和/或BCL6易位的“双打击或三打击”淋巴瘤侵袭性更强,治疗效果更差,平均生存率更低。2016年淋巴瘤新分类中,将伴有“双打击或三打击”的弥漫性大B细胞淋巴瘤和形态特征介于弥漫性大B细胞淋巴瘤和Burkitt淋巴瘤之间的不能分类B细胞淋巴瘤称为高级别B细胞淋巴瘤,后者不伴有“双打击或三打击”的称为高级别B细胞淋巴瘤,非特殊型。本实验旨在研究弥漫性大B细胞淋巴瘤和形态特征介于弥漫性大B细胞淋巴瘤和Burkitt淋巴瘤之间的不能分类B细胞淋巴瘤中MYC和BCL2或BCL6蛋白双表达和MYC/BCL2和/或BCL6“双打击或三打击”情况及临床病理特征,并同时研究Ki67和EZH2的相关性及EZH2的应用价值。二、实验方法:选取华中科技大学同济医学院附属同济医院确诊为弥漫性大B细胞淋巴瘤及形态特征介于弥漫性大B细胞淋巴瘤和Burkitt淋巴瘤之间的不能分类B细胞淋巴瘤患者的石蜡包埋组织,共47例,另选取6例扁桃体炎患者作为对照组。1、用荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)DNA探针检测MYC/8q24,BCL2/18q21及BCL6/3q27的分离信号,用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)检测MYC、BCL2及BCL6蛋白表达情况。根据提供的临床资料,用SPSS统计学软件计算P值,比较“双打击或三打击”和双表达淋巴瘤在国际预后指数(International Prognostic Index,IPI)及其相关临床参数上的差异。2、行EZH2、Ki67免疫组织化学检测,观察EZH2和Ki67蛋白表达情况,分析其相关性。三、实验结果:1、fish结果47例患者均用fishdna探针检测myc/8q24,bcl2/18q21及bcl6/3q27的分离信号,结果显示:3例(6%)患者发生“双打击或三打击”(1例dlbcl患者发生myc/bcl2易位,1例bclu患者发生myc/bcl2易位,1例bclu患者发生myc/bcl2/bcl6易位),未检测到myc/bcl6易位。其中,伴有myc/bcl2易位的dlbcl为生发中心型(germinalcenterbcell,gcb):cd10(弱+)、bcl6(+)、mum1(-)。2、ihc结果在这47例淋巴瘤患者中myc和bcl2或bcl6蛋白双表达患者共25例(53%),其中myc+/bcl2+/bcl6-双表达患者14例,myc+/bcl6+/bcl2-双表达患者5例,myc+/bcl2+/bcl6+三表达患者6例。在弥漫性大b细胞淋巴瘤中,myc+/bcl2+/bcl6-双表达淋巴瘤患者好发于non-gcb型(38%v10%),myc+/bcl6+/bcl2-双表达淋巴瘤患者好发于gcb型(p=0.032)。3、“双打击或三打击”淋巴瘤和双表达淋巴瘤患者临床特点3.1“双打击或三打击”淋巴瘤患者临床特点与无“双打击”淋巴瘤患者相比,“双打击或三打击”淋巴瘤患者病变范围广,stage临床分期多处于Ⅲ或Ⅳ期(p=0.042),有更高的ipi值(p=0.05)。另外,在本实验中3例淋巴瘤患者ki67增值指数均≥90%,但不能作为预测myc/bcl2易位的指标(p=0.262>0.05)。3.2双表达淋巴瘤患者临床特点myc/bcl6双表达淋巴瘤患者与无myc/bcl6双表达淋巴瘤患者相比,ipi值无明显差异(p=0.726)。提示myc/bcl6双表达不能作为淋巴瘤患者不良预后指标。根据myc和bcl2蛋白表达情况,将47例淋巴瘤患者分为3组:(1)myc<40%、bcl2<70%;(2)myc≥40%、bcl2<70%或myc<40%、bcl2≥70%;(3)myc≥40%、bcl2≥70%。结果显示:myc/bcl2双表达淋巴瘤患者较无myc/bcl2双表达或myc、bcl2中单表达淋巴瘤患者有明显高的ipi值((1)v(2)p=0.633,(2)v(3)p=0.034<0.05,(1)v(3)p=0.038<0.05),提示myc/bcl2双表达可作为淋巴瘤患者不良预后指标。另外,本实验中高ki67增值指数不能作为预测有myc/bcl2双表达的指标(比较不同阈值,p值均>0.05)。3.3“双打击或三打击”淋巴瘤和双表达淋巴瘤患者临床特点比较根据myc/bcl2双表达淋巴瘤患者临床表现,从患者年龄、性别、临床分期、乳酸脱氢酶水平、体力状态、结外累及和ipi值方面分别与“双打击或三打击”淋巴瘤患者进行比较(见表1)。结果显示:myc/bcl2双表达淋巴瘤患者与“双打击或三打击”淋巴瘤患者在上述临床参数及ipi值上无统计学差异(p>0.05),提示双表达淋巴瘤患者与“双打击”淋巴瘤患者预后均不良,接受标准化学疗法后生存率相似。另外,用不同阈值比较“双打击”淋巴瘤和双表达淋巴瘤患者ki67增殖指数的区别(见表1),结果显示p值均大于0.05,故无明显差异。4、ki67和ezh2相关性47例淋巴瘤患者及6例慢性扁桃体炎患者(对照)行ki67和ezh2免疫组织化学检测,结果显示:在弥漫性大b细胞淋巴瘤和形态特征介于弥漫性大b细胞淋巴瘤和burkitt淋巴瘤之间的不能分类b细胞淋巴瘤中ezh2与ki67蛋白表达相关系数分别是r=0.677(显著性p=0)和r=1.000(显著性p=0),具有强相关性,因此认为ezh2可以代替ki67增殖指数,衡量肿瘤细胞增殖情况。并且ezh2在弥漫性大b细胞淋巴瘤中比在形态特征介于弥漫性大b细胞淋巴瘤和burkitt淋巴瘤之间的不能分类b细胞淋巴瘤中表达低(p=0<0.05),提示ezh2的表达和肿瘤侵袭性有关。四、实验结论:1、“双打击或三打击”淋巴瘤患者较无“双打击”淋巴瘤患者有更高的临床分期及ipi值。2、MYC/BCL6双表达淋巴瘤患者与无MYC/BCL6双表达淋巴瘤患者相比,IPI值无统计学差异,MYC/BCL2双表达淋巴瘤患者较无MYC/BCL2双表达或MYC、BCL2中单表达淋巴瘤患者有明显高的IPI值。3、MYC/BCL2双表达淋巴瘤患者与“双打击或三打击”淋巴瘤患者的IPI值及相关临床参数无统计学差异,提示接受标准化学疗法后生存率相似.4、高Ki67增值指数不能作为预测MYC/BCL2易位及双表达的指标。5、在弥漫性大B细胞淋巴瘤及形态特征介于弥漫性大B细胞淋巴瘤和Burrkit淋巴瘤之间的不能分类B细胞淋巴瘤中Ki67和EZH2具有强相关性。