论文部分内容阅读
目的:1.分离、培养和鉴定不同供体性状(手术切除脂肪组织块及吸脂术脂肪悬液)的人脂肪组织来源的干细胞(ADSCs)。观察其生物学特性、干细胞活性的差异。2.体外模拟角膜上皮生长、分化的微环境,对不同方法提取的人ADSCs进行单独/联合诱导,探讨其向角膜上皮样细胞分化的潜在能力,及诱导分化的可行途径。方法:1.改良方法分离、纯化人ADSCs,使用改良的体外扩增培养液进行体外培养。2.MTT法测定ADSCs增殖曲线。流式细胞仪检测传3～5代的CD29、CD34、CD49d、CD105、CD106表达率。进行成脂、成骨多向诱导,2周后用油红O及碱性磷酸酶法鉴定分化能力。对2种性状提取之细胞的表型及增殖、分化能力进行比较。3.应用CFDA SE标记人ADSCs。采用组织块培养法体外提取大鼠角膜上皮细胞,并制作无上皮、内皮细胞的大鼠角膜基质,用于ADSCs的联合诱导。4.CFDA SE标记的人ADSCs与大鼠角膜上皮细胞各自爬片,并列培养于同一体系,观察人ADSCs迁徙情况。5.在不同培养液体系(角质细胞培养体系、间充质细胞体外扩充培养体系及上述二者等积混合的中间体系)内添加梯度浓度0～50ng/mL EGF,及50ng/mL EGF基础上添加的10,20ng/mLbFGF,对ADSCs进行单独诱导。采取光镜、电镜、免疫组织化学染色、免疫荧光染色的手段,观察诱导21d后ADSCs形态学的改变及角膜特异性蛋白AE5(CK3/CK12)的表达情况,比较不同培养体系及不同浓度生长因子对ADSCs诱导作用的差异。6.在Transwell体系上层放置大鼠角膜上皮细胞或角膜基质,下层放置人ADSCs,选择不添加/添加40ng/mL EGF的角质细胞培养体系对人ADSCs进行联合诱导,采用免疫荧光染色法观察诱导30d后ADSCs细胞角蛋白谱AE1和角膜特异性蛋白AE5的表达情况,比较添加/不添加EGF、单独诱导/角膜上皮细胞联合诱导/角膜基质联合诱导对人ADSCs诱导成功率的差异。7.单独诱导2种性状提取的ADSCs,比较诱导后30d二者AE1、AE5阳性率差异。结果:1.不论脂肪块还是脂肪悬液,均可通过上述方法获取大量高纯度的ADSCs。但后者的操作流程更为省时、省力,获取的细胞量相对较多。流式细胞仪测定传3代至传5代的ADSCs,两个不同供体性状的细胞均为CD34~-、CD106~-、CD29~+、CD49d~+、CD105~+。皮下组织块来源的ADSCs传3代的表型CD29~+、CD49d~+细胞分别占82.5%和8.0%,传至5代逐渐增加为89.4%、70.1%;CD105~+细胞则稳定于80%左右。吸脂术提取的ADSCs传3～5代的表型较为稳定,CD29~+、CD49d~+、CD105~+表达分别在99%、40%、80%左右,与皮下组织块组比较,传3～5代的CD29和传5代的CD49d阳性率有统计学差异(P＜0.01)。MTT比色法显示,ADSCs增殖活性随传代次数增加而增加。另外,ADSCs分别进行成脂/成骨体外诱导,2周后油红O、碱性磷酸酶染色,均见阳性结果,皮下组织块组2者阳性率分别为81.6%、26.5%,吸脂术组为64.6%、29.3%。2.CFDA SE标记的ADSCs在营养状态欠佳的角膜上皮细胞诱导下迁徙、并逐渐包绕、替代后者。另外,角质细胞培养体系培养下的ADSCs向角膜上皮样细胞分化的阳性率具有EGF浓度依赖性;bFGF则对分化有抑制性作用。而另2个体系对各浓度EGF、bFGF对ADSCs诱导作用均为阴性。3.相同培养体系作用下的不同诱导组,以添加EGF刺激下的角膜基质联合诱导组AE5~+ ADSCs的比例最高,可达97.7%,AE1表达则为0,提示向成熟的角膜上皮样细胞分化。其次为单独诱导组,AE5~+比率为75.4%(添加EGF)、46.0%(未添加EGF),AE1~+比率为86.0%(添加EGF)、96.5%(未添加EGF),分化欠成熟。未添加EGF刺激下的角膜基质联合诱导组AE5、AE1阳性率最低,分别为2.4%、51.2%。4.角质细胞培养体系下,皮下组织块组在EGF的刺激下AE5~+100%、AE1~-0%,而无EGF的作用下则分别为16.6%、97.7%。该组细胞分化能力强于吸脂术组。结论:1.本研究通过改良的方法,成功地从人皮下脂肪组织及吸脂术废弃液中分离、培养了高纯度脂肪组织来源的干细胞,并经体外条件诱导证实具备多向分化潜能,可以作为一种优良的组织工程、细胞治疗和基因治疗的种子细胞。2.本研究中,在Transwell体系内,添加40ng/mL EGF的角质细胞培养液联合角膜基质进行诱导,是体外诱导ADSCs向角膜上皮样细胞分化的最佳方法。另外,皮下脂肪组织来源的ADSCs具备更好的分化能力,更适用于将来的临床治疗;而吸脂术提取的细胞由于工序相对简单、来源更为充足,更适用于实验室研究。3.CFDA SE是一种稳定的细胞示踪剂,可作为今后体内动物实验的细胞示踪的很好手段。