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φC31整合酶是一个位点特异的重组酶,可有效介导细菌附着位点(attB)和噬菌体附着位点(attP)之间的特异重组。研究发现其也可介导携带有attB序列的外源基因定点整合入哺乳动物基因组中的假attP位点。 Cre/Loxp系统是一个常用的基因重组系统,由两个部分组成:一个是Cre重组酶,另一个是Cre重组酶识别的LoxP位点。Cre重组酶能高效介导两个LoxP位点间发生重组反应,如果两个LoxP位点位于一条DNA链上,且方向相同,Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列。 自裂解多肽2A是一段长度介于18到22个氨基酸之间的多肽,首先发现于小RNA病毒,继而在昆虫病毒,轮状病毒等中都有发现,其可应用在多顺反子载体构建中,并且具有结构短小,上下游基因表达平衡性好,可用于共表达多个蛋白等优点,是一种构建多顺反子载体的有效工具。 本文首先用来自一点褐翅蛾的自裂解多肽T2A作为共表达的工具,构建了共表达载体pCMV‐GFP‐T2A‐Neo。用pCMV‐GFP‐T2A‐Neo转染牛耳皮肤成纤维细胞24小时后,经FACS检测,有5.97％的细胞表达GFP。进行G418筛选后能够获得具有G418抗性,并且稳定表达GFP的克隆,说明用T2A连接的GFP和Neo在转入细胞后能够正常翻译和表达,T2A在牛耳皮肤成纤维细胞中具有自裂解功能。 用pCMV‐GFP‐T2A‐Neo转染牛耳皮肤成纤维细胞48小时后,提取总RNA做real‐time PCR,检测GFP,T2A和Neo三个基因在mRNA水平的情况。实验结果证明GFP,T2A和Neo在mRNA水平上都有显著表达,并且表达的量都处于一个数量级,T2A能作为一种平衡性较好的共表达策略应用在牛耳皮肤成纤维细胞中。 在以上工作的基础上,选定T2A作为共表达策略,构建了可诱导的去标记基因载体pTBCNTG。这个载体上含有attB位点,并且把标记基因GFP,正负筛选基因,CreER重组酶基因及其它载体骨架置于两个同向的LoxP位点之间。pTBCNTG在整合酶的作用下能够通过其上的attB位点高效整合入牛基因组中的假attP之中,通过他莫苷芬诱导CreER重组酶表达,实现对标记基因和其它载体骨架的删除。相信随着进一步研究,这个载体能够应用到安全高效的转基因牛制备体系中。