前言砷是一种广泛存在的环境毒物,可以诱导细胞产生氧化应激反应,包括无机砷和有机砷。人类砷暴露主要是饮用含砷的地下水源或者医用含砷药物导致。砷是法医学实践中经常涉及的一种毒物,由于急性砷中毒的症状不明显或慢性砷中毒的毒物检出量很低,所以研究砷暴露对人体的损害及其机制也会为砷中毒的法医学鉴定提供证据。当人类长期暴露于无机砷后,会出现多种疾病,包括多脏器肿瘤、高血压、糖尿病和皮肤损害。砷暴露致皮肤损害的类型包括良性的皮肤色素代谢异常和皮肤过度角化,恶性病变包括皮肤Bowen氏病和皮肤的恶性肿瘤。尽管砷是明确的皮肤毒物,但砷致皮肤损害的机制尚不清楚。前期的研究表明砷可以诱导细胞发生氧化应激反应并可导致氧化性DNA损伤。因此砷致皮肤损害的机制很可能与细胞的氧化应激反应有关。转录因子NF-E2相关因子是CNC家族成员之一,包括NRF1、NRF2和NRF3,这些转录因子在细胞氧化应激反应引发的细胞适应性变化过程中发挥重要作用。因此,本研究旨在探讨NRFs在砷致体外培养的HaCaT细胞抗氧化反应和细胞毒性中的作用及其机制,从而阐明砷致皮肤损害的机制,为预防和治疗砷致皮肤过度角化和皮肤癌提供理论依据,同时探讨NRFs在法医学实践中鉴定砷中毒的应用价值。方法本实验应用慢病毒为载体的sh-RNA,在体外培养的HaCaT细胞中制作NRF1、NRF2、NRF3和KEAP1选择性基因沉默(knockdown, KD)的细胞模型,应用qReal time RT-PCR和Western blotting技术观察砷暴露条件下NRFs、KEAP1和一系列ARE目的基因表达,观察选择性基因沉默的细胞内ARE目的基因表达的变化,探讨NRFs的激活机制和对ARE目的基因的调控作用,同时应用MTT方法和流式细胞仪技术检测选择性基因沉默的细胞对砷诱导的细胞毒性的反应变化,从而阐明NRFs在砷诱导的细胞抗氧化反应过程中的作用。此外,应用荧光素酶活性检测试剂(Luciferase Activity)观察砷对HaCaT细胞内的ARE活性的影响。结果流行病学调查结果表明慢性砷暴露导致的典型皮肤病理学改变有助于法医学实践中判定慢性砷中毒。MTT和流式细胞仪结果显示,在体外培养的HaCaT细胞内,NRF2的沉默明显增强砷诱导的细胞毒性,KEAP1是NRF2的抑制因子,该分子沉默的细胞表现出明显拮抗效应。然而,NRF1的沉默也可以增强细胞对砷诱导的细胞毒性的敏感性,但其程度较NRF2沉默的细胞弱。NRF3的基因沉默细胞对砷诱导的细胞毒性没有明显变化。为了探讨其机制,在砷暴露的条件下,我们对NRFs的表达和一系列氧化应激反应相关基因,如NQO1、GCLC、GCLM、HMOX-1、SRX等基因进行检测。实验结果表明砷和其他的NRF2的激活因子(如tBHQ和Sulforaphane)不同,砷不仅可以激活NRF2还可以激活NRF1的表达,而且存在明显的时间和剂量效应。NRF1是在细胞内质网内发生糖基化的蛋白。糖基化的过程明显影响砷对ARE活性的激活。砷可以激活NRF1并引起NRF1的核内聚集,实验结果还显示过糖基化和非糖基化的蛋白仍可以转录到核内。NRF1在细胞内通过调控GCLC和GCLM的表达而影响细胞内GSH水平,另外NRF1还可以调控NQO1的表达,但NRF1对细胞内HMOX-1的表达几乎没有影响。砷暴露对NRF2的激活作用很明显,低剂量的砷即可激活细胞内NRF2的表达,而且NRF2可调控细胞内NQO1、HMOX-1、GCLC、GCLM和SRX等ARE基因的表达,从而对砷诱导的细胞毒性产生细胞保护作用。KEAP1作为NRF2的负性调节因子,其沉默后在正常生理状态下,上调NRF2的表达并调控ARE相关基因的表达增强,但该分子的沉默并不能导致砷诱导的细胞内ARE相关基因表达的进一步增加,说明KEAP1对NRF2的调控作用非常显著。值得提出的是KEAP1的沉默可下调细胞内HMOX-1的表达,说明细胞内HMOX-1表达的调控存在复杂的机制。砷暴露可导致NRF3的基因表达变化,但NRF3的基因沉默并未引起细胞对砷诱导的细胞毒性和抗氧化反应的异常,而且NRF3对ARE目的基因的表达基本没有调控作用。在我们针对选择性基因沉默细胞的研究发现,NRFs和KEAP1之间存在复杂的相互作用和调控机制。在三价无机砷暴露的情况下,NRF1的沉默并不影响细胞内NRF2的表达水平,但在该细胞内,NRF3的基因表达水平上调,而KEAP1的表达水平下调,说明NRF1和KEAP1很可能存在相互作用。在NRF2选择性沉默的细胞内,NRF1的蛋白水平和NRF3的基因表达均上调,KEAP1的表达下调,说明NRF1和NRF3在砷暴露下可以弥补NRF2沉默导致的功能障碍,而且NRF2和KEAP1存在结合和相互调控。KEAP1基因的沉默导致细胞内NRF2蛋白表达水平的上调,尤其是细胞核内的聚集,但该分子的沉默却导致了NRF1蛋白表达的下调,说明NRF1和NRF2存在竞争性结合ARE位点的作用机制,而且进一步确定了NRF1和KEAP1之间可能存在相互结合。NRF3基因的沉默不影响细胞内NRF1、NRF2和KEAP1的表达水平。说明NRF3可能是一种相对独立的转录因子。另外,我们使用了多种化合物和重金属毒物,发现只有砷可以激活NRF1。结论1.砷可以激活NRF1和NRF2,其蛋白表达并且存在时间和剂量依赖性；2.NRF1和NRF2在砷诱导的细胞毒性中发挥保护性作用；3.NRF1可以调控细胞内GCLC、GCLM、SRX和NQO1的表达水平,NRF2不仅调控上述基因,对HMOX-1的调控作用也很明显。NRF2在调控ARE相关基因的作用比NRF1强；4KEAP1的沉默在正常生理状态下即可导致NRF2的蛋白聚集及NRF2调控的ARE目的基因的表达,增强包括GCLC、GCLM、SRX、NQO1的表达,但在砷诱导的情况下,KEAP1的沉默并不能进一步增高砷导致的ARE目的基因的增高；5NRFs和KEAP1之间的相互作用：(1)NRF1和NRF3可以弥补NRF2的沉默,而NRF2不能弥补NRF1的沉默；(2)NRF1和NRF2的沉默导致KEAP1的表达下降。(3)KEAP1的沉默导致NRF2蛋白表达的上调,尤其是核内的聚集；(4)NRF3对NRF1和NRF2及KEAP1的基因和蛋白表达没有影响。本项研究发现为砷暴露介导的皮肤永生表皮细胞(HaCaT)的抗氧化反应提供了证据,有助于我们理解砷暴露导致的皮肤损害的机制,为治疗和预防砷致皮肤损害提供了新的理论依据；(5)慢性砷暴露人群的典型皮肤病理学改变有助于法医学实践中判定慢性砷中毒；NRF1的蛋白激活可成为法医学鉴定砷中毒的特异性指标。