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MicroRNAs(miRNAs)是一种长度约为22 nt的小的非编码RNAs,可与靶mRNAs 3’端非翻译区结合,甚至与其编码序列及启动子结合,抑制mRNA翻译和/或引起mRNAs降解。MiRNAs具有影响多种细胞过程的能力,包括:重编程、增殖、分化及凋亡。MiR-302s/367 cluster具有将小鼠和人体细胞重编程为多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的能力,抑制多种类型癌细胞的增殖,甚至引起癌细胞凋亡。然而,miR-302s/367 cluster在其他哺乳动物中的功能还未被探究。本研究中,将人工合成的precursor miR-302s/367 cluster(pre-miR-302s/367cluster)片段插入entry载体pcDNA?6.2-GW/EmGFP-miR中,随后,通过gateway技术将该片段重组到destination载体pT-RE-DEST30中,并对重组载体进行鉴定。采用Lipofectamine 3000转染的方法将重组载体pT-REx-DEST30及pcDNA 6/TR载体导入体外培养的绵羊胎儿成纤维细胞(sheep fetal fibroblast cells,SFFs)中,采用G418及Blasticidin对转基因SFFs进行筛选。转基因SFFs培养于添加(Tet-on)及未添加(Tet-off)终浓度为1μg/mL四环素(Tetracycline,Tet)的培养液中,四环素可诱导转基因SFFs中pre-miR-302s/367 cluster及EmGFP的表达。采用荧光倒置显微镜及stem-loop RT qPCR对转基因SFFs中miR-302s/367 cluster及EmGFP的表达进行检测。分别采用CCK法、流式细胞技术对(Tet-on)/(Tet-off)转基因SFFs的增殖、凋亡进行检测。提取(Tet-on)/(Tet-off)转基因SFFs的RNA,采用高通量RNA-seq技术检测细胞中RNA的表达。提取(Tet-on)/(Tet-off)转基因SFFs的基因组DNA及组蛋白,采用ELISA方法对其基因组DNA甲基化及组蛋白H3乙酰化水平进行检测,借此探讨miR-302s/367 cluster对基因表达及表观遗传修饰模式的影响。具体结果如下:1.通过gateway重组技术成功构建重组destination载体pT-REx-DEST30。2.成功获得转基因SFFs。培养液中添加终浓度为1μg/mL四环素可成功诱导(Tet-on)转基因SFFs中EmGFP及miR-302s/367 cluster的表达,miR-302s cluster及miR-367的表达量约是内参基因U6表达量的21倍及4倍。3.经四环素诱导miR-302s/367 cluster表达3 d后,(Tet-on)转基因SFFs的增殖率显著低于(Tet-off)转基因SFFs的增殖率;而(Tet-on)转基因SFFs的凋亡率(4.76±0.31%)显著低于(Tet-off)转基因SFFs的凋亡率(14.21±0.41%)。在诱导miR-302s/367 cluster表达7 d后,(Tet-on)转基因SFFs的细胞形态向上皮样转变。4.高通量RNA-seq共获得42.57 G的clean data,6个样品中测序质量Q20最小值为96.23%,Q30最小值88.51%,clean reads ratio最小值为98.06%,均符合公认的要求:Q20要在95%以上、Q30要求大于85%。差异表达基因分析结果将研究重点锁定到与PI3K信号途径及细胞周期信号途径相关的基因上,通过RT qPCR验证了(Tet-on)转基因SFFs中PI3K、c-Myc、CDK6、cyclin D1的表达水平显著上调,而CDK2、cyclin E1、cyclin E2、E2F1和E2F2的表达水平显著下调,而P15INK4B的表达水平没有发生显著变化。5.经四环素诱导miR-302s/367 cluster表达7 d后,(Tet-on)转基因SFFs的DNA甲基化水平(0.157%)显著低于(Tet-off)转基因SFFs的DNA甲基化水平(0.324%);而(Tet-on)转基因SFFs的组蛋白H3乙酰化水平(0.84%)显著高于(Tet-off)转基因SFFs的组蛋白H3乙酰化水平(0.55%)。通过RT qPCR检测到(Tet-on)转基因SFFs中DNA甲基化相关基因DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、AOF1、AOF2的表达量均显著下调,组蛋白H3乙酰化相关基因HDAC1和HDAC2的表达量也显著下调。