家蚕作为鳞翅目模式昆虫,其整个体腔都处于循环血淋巴中。血淋巴起着调节,储藏,防御,传递压力和愈伤等作用,其中免疫作用占据着非常重要的地位。根据形态的不同,家蚕血细胞可分为五种类型,即原血细胞,颗粒细胞,浆细胞,拟绛色细胞和小球细胞,但血细胞在体内的增殖分化、发育形成过程及造血谱系仍少有研究。整合素(integrin)是一类存在于细胞表面的跨膜蛋白,广泛存在于生物体中,由α亚基和β亚基组成。在哺乳动物中,目前共发现了 19个α亚基和8个β亚基。其可以调节细胞粘附、增殖、存活,并在细胞凋亡、变形、细胞间接触、基因表达、细胞分化过程中发挥重要作用。昆虫体内的整合素可作为血细胞特异标记物,且在血细胞对外源物的包囊反应等免疫过程中起关键作用。基于家蚕基因组数据库,本研究筛选并鉴定得到一个血液特异性基因,命名为Bmintegrinβ2。经克隆、表达分析、抗体制备、免疫荧光等一系列实验证实Bmintegrinβ2是一个潜在的家蚕浆细胞分子标记,能够特异识别家蚕浆细胞。我们利用这一特异的分子标记对家蚕浆细胞的起源进行初步的探索。主要研究结果如下:1.Bmintegrin β2全长克隆及分析通过分析家蚕基因组芯片数据库,筛选发现一个家蚕整合素基因BGIBMGA006002(Bmintegrn β2)在血液中特异高表达。利用RACE技术,克隆得到包括其完整ORF序列在内的cDNA序列。其mRNA全长为2434bp,编码蛋白为562aa。与其他整合素成员一致,Bmintegrinβ2含有一个较长的胞外域,一个单次跨膜结构域和一个较短的胞内域。与各物种中的integrin β2同源序列进行多序列比对,构建系统发生树,结果显示Bmintegrinβ2较为保守,且与烟草天蛾β亚基聚为一类,为其同源蛋白。2.Bminteg β2 表达分析利用qRT-PCR检测Bmintegrinβ2在家蚕5龄3天各组织中的表达情况,发现其在血细胞中特异并高量表达。而qRT-PCR检测Bmintegrin β2在家蚕胚胎各时期的表达情况时,发现胚胎第7天,Bmintegrinβ2开始表达,直到胚胎末期都维持一个较高的表达水平,说明浆细胞在胚胎第7天逐渐开始产生,之后一直存在于循环血淋巴中。进一步检测其在幼虫各时期血细胞中的表达情况,发现其表达量在整个幼虫时期都维持在一个较高的表达水平,且在五龄6天时达到最高值。3.Bmintegrin β2特异标记家蚕浆细胞选取Bmintegrin β2编码框中N端220bp的特异片段,原核诱导表达,蛋白纯化,通过免疫大鼠后获得免疫血清。利用免疫血清进行Western blot检测原核诱导产物,结果显示免疫血清能够特异识别重组表达的Bmintegrinβ2蛋白。免疫荧光检测家蚕循环血细胞,发现免疫血清在体内能够特异识别家蚕循环血细胞中的浆细胞。通过与DAPI共染,发现Bmintegrinβ2的信号均匀分布于浆细胞细胞膜上,推测该蛋白在体内执行功能时主要位于细胞膜上。免疫荧光显示造血器官中也存在浆细胞。4.家蚕幼虫循环血细胞中浆细胞来源探究家蚕幼虫造血器官体外培养实验显示造血器官可以释放出浆细胞。而当造血器官剥离后,随时间延长,家蚕生长状态良好,循环血细胞总数基本不变,但浆细胞比例逐渐降低,且浆细胞增殖率几乎为零,表明家蚕幼虫循环血淋巴中的浆细胞主要来源于造血器官,而非自我增殖产生的。