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近年来，干旱和盐胁迫已成为影响作物产量与品质的重要限制因素。随着分子生物学研究的不断发展，越来越多的干旱及盐胁迫应答基因被发现。花生是我国最重要的油料作物之一，其总产量约占我国油料作物的49％。花生的抗旱耐盐研究相对较少，仅有少量基因和转录因子被克隆。因此，发掘花生逆境相关基因，明确花生逆境基因表达调控机理对花生抗逆育种具有重要意义。 膜联蛋白(Annexin)是一类依赖Ca2+或者磷脂结合的多功能蛋白，在生物体内通常以多基因家族形式存在。高等植物膜联蛋白广泛分布在植物生长和发育的各个组织，并参与多种生理进程，如膜建成、细胞生长、豆科作物的根瘤形成以及果实成熟等。许多研究已表明膜联蛋白在细胞信号转导、维持膜结构稳定性、细胞分泌过程以及植物响应逆境中起着重要作用。基于膜联蛋白的功能，本研究将膜联蛋白基因作为花生抗逆研究的候选基因，通过同源克隆的方法，从抗逆、广适花生品种冀花2号叶片中分离了膜联蛋白基因AnnAhs，利用荧光实时定量分析了不同处理及不同组织中AnnAhs的表达特性，并对其功能进行了初步验证，主要研究结果如下: 1.AnnAhs基因的克隆及序列分析:克隆到花生中6个不同全长和2个部分序列的新膜联蛋白基因AnnAhs，命名为AnnAh1，AnnAh2，AnnAh3，AnnAh5，AnnAh6，AnnAh7，AnnAh4和AnnAh8(基因登录号分别为KM267643，KM276779，KM276780，KM276781，KM276782,KM276783,KM276784和KM276785)。AnnAh1,AnnAh2,AnnAh3,AnnAh5,AnnAh6和AnnAh7的开放阅读框分别为951 bp，954 bp，966 bp，948 bp，948 bp和1002bp。在核苷酸水平上，AnnAhs的编码区域相似一致性为46.23-66.56％，相对应的氨基酸序列的同源性在17.93-65.72％之间。所有预测的ANNAhs蛋白的分子量在35.85-36.29 KD之间，但是推断的等电点差异较大为5.97-8.81。推测的ANNAhs具有annexin家族典型的特征，即ANNAhs在第一或者第四个重复单元中包含典型的typeⅡCa2+-binding site(G-X-G-T-(38)-D/E)以及S3 clusters等保守的残基/元件。除ANNAh7外，其他5个ANNAhs N末端区域具有保守的His残基。 2.ANNAhs序列的进化分析:系统发育树表明ANNAhs被区分在不同的组间，并与同组内的豆科作物亲缘关系最近，除ANNAh2与拟南芥的亲缘关系近外，其他成员与拟南芥、玉米的亲缘关系较远。同组内的annexins保守motifs模式一致。 3.AnnAhs基因组序列的克隆和序列分析:扩增到AnnAhs基因组序列和启动子区域。AnnAhs基因外显子和内含子剪接位点剪接方式符合经典的GT-AG规律。同一组中花生和豆科作物的annexin基因组外显子-内含子组织具有相似的分布（第一个内含子的位相为1，其他位相为0），且annexin相对应的外显子长度具有一致性。启动子预测分析表明，AnnAhs启动子元件含有典型的TATA-box、CAAT-box和一系列光响应元件G-box，box4和SP1等，但是一些重要的调控元件，SA响应元件TCA-element，ABA响应元件ABRE，低温响应元件LTR、干旱响应MYB结合位点MBS、厌氧诱导必要的顺式作用元件ARE以及热胁迫响应等调控元件只存在于特定的基因中，说明AnnAhs的表达可能受低温、干旱、缺氧及光照等环境因素的调控。 4.多重胁迫及不同组织下花生内参基因的筛选:利用实时定量PCR对11个候选内参基因的表达稳定性进行了筛选，通过geNorm软件、NormFinder软件和BestKeeper分析筛选到本研究处理组表达模式分析的内参基因EFL1B，YLS8，UBI1和ACTIN7。 5.AnnAhs基因的表达特性分析:正常条件下AnnAhs在花生根、茎、叶和花中均有表达，并表现出不同的表达模式。6个AnnAhs均为组成型表达基因。花生中AnnAhs基因的转录水平响应干旱、盐、重金属、低温以及外源激素处理的调节，推测AnnAhs基因在花生抗逆调控中起着一定的作用。 6.AnnAhs基因的功能分析:成功构建了AnnAhs基因过表达载体pBI121-AnnAhs，并转化烟草。对pBI121-AnnAh1和pBI121-AnnAh3 T1代的功能验证显示，甘露醇处理下，野生型烟草的受害程度明显高于转基因幼苗;叶盘法分析发现，与水处理相比，野生型叶绿素含量降低14％～26％;各转基因株系pBI121-AnnAh1-x（10，25和42）和pB I121-AnnAh3-x(11和54)的变异系数分别为1.4％～10％，1.3％～11％，3.6％～12％，5.2％～13％和2.8～12％均显著小于野生型的变化;NaCl处理下，野生型烟草的受害程度明显高于转基因幼苗pBI121-AnnAh1-x，而pBI121-AnnAh3-x的受害程度与野生型相似;叶盘法分析发现，与水处理相比，野生型烟草的叶绿素含量降低19％～39％，pBI121-AnnAh1-x各转基因株系10，25和42叶绿素含量变化的最大变异系数分别为21％，23％和24％，pBI121-AnnAh3-x（11和54）的最大变异系数分别为37％和40％。说明转AnnAh1 T1代烟草能够提高转基因烟草在干旱和盐胁迫下的抗性;转AnnAh3 T1代烟草能够提高转基因烟草在干旱胁迫下的抗性，但对盐胁迫表现出一定的敏感。