研究背景阿片类药物在治疗各种伤害性刺激（手术、创伤等急性疼痛，各种慢性疼痛）的同时会带来许多不良反应，如药物依赖，耐受，成瘾及阿片药物诱导痛觉过敏（Opioid induced hyperalgesia,OIH）等。急性OIH被IASP定义为“基于阿片样物质的麻醉和手术后的疼痛感知增加”。瑞芬太尼是超短效的μ-阿片受体激动剂被广泛应用于全身麻醉中的镇痛,其产生痛觉过敏的发生率明显高于其他阿片类药物。研究表明中枢系统NMDA受体功能和数量的改变在瑞芬太尼痛觉过敏的形成过程中发挥了重要的作用,但目前针对脊髓背角神经元NMDA受体GluN1亚基功能改变和关键蛋白激酶在瑞芬太尼痛觉过敏机制的报道不多。本研究旨在从整体、亚细胞、分子等不同水平以非切口疼痛细胞模型研究瑞芬太尼对NMDA受体电生理变化的影响；瑞芬太尼、氯胺酮、纳洛酮对GluN1磷酸化激活的影响；蛋白激酶C（PKC）和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CaMKII）对GluN1磷酸化的影响三个方面阐述由瑞芬太尼诱发的GluN1亚基活性改变，探讨GluN1磷酸化在OIH中的机制及作用，从而推断在初级传入感觉神经元谷氨酸受体调节和其在OIH发生和维持阶段的作用，以期为进一步研究阿片受体、NMDA受体在OIH乃至神经元退行性变以及急性疼痛慢性化演变的作用与机制，开发新的疼痛治疗药物奠定基础。蛋白磷酸化是离子型谷氨酸受体NMDA翻译后修饰的重要机制，GluN1亚基C末端具备多个丝/苏氨酸磷酸化位点，通过对这些不同的位点进行结构磷酸化和活性依赖的磷酸化引起细胞和突触输入可逆的变化。本研究拟以大鼠脊髓背角神经元痛觉过敏模型为基础,探讨影响GluN1磷酸化的各种因素，从而揭示μ受体—Ca2+—PKC和CaMKII—GluN1受体激活的信号转导途径机制，证明瑞芬太尼对脊髓背角神经细胞NMDA受体GluN1亚基功能和表达的影响以及PKC和CaMKII在急性OIH发生发展中的调节作用。第一部分急性瑞芬太尼暴露后脊髓NMDA受体电生理变化特点目的：探讨脊髓背角神经元细胞在急性瑞芬太尼暴露后N-甲基-D-天冬氨酸(GluN）的电流活动的浓度和时间变化特点，明确最大电流对应的药物浓度。方法：原代培养E18-19d的胚胎大鼠脊髓背角神经细胞，随机分为4组，对照组（C组）给予生理盐水，R1组（4nM）, R2组（6nM), R3组（8nM）瑞芬太尼作用原代大鼠脊髓背角神经元细胞60min后，采用全细胞膜片钳技术记录瑞芬太尼作用前（T0)、20min（T1)、40min（T2）、60min（T3）、80min（T4）、100min（T5）的电流。结果：与C组相比，R1组、R2组、R3组在各时间点最大电流振幅均显著升高，并呈显著的时间依赖性，4nM瑞芬太尼（R1组）与6nM（R2组）、8nM（R3组）最大电流振幅在T2、T3、T4显著增加（P<0.05）；呈现迅速而持久的变化趋势。结论：4nM瑞芬太尼对GluN的电流增幅相比6、8nM瑞芬太尼明显。瑞芬太尼导致大鼠背角神经元GluN的快速且持久的电活动增加可能是OIH的电生理基础，其对应的分子机制尚不明确，以4nM瑞芬太尼为研究对象进行以下研究。第二部分瑞芬太尼诱导的脊髓GluN1亚基磷酸化目的：研究大鼠脊髓背角神经元经急性瑞芬太尼暴露后GluN1亚基发生磷酸化及其时间依赖性；氯胺酮、纳洛酮对GluN1的磷酸化的影响。方法：原代培养大鼠脊髓背角神经元分为6组，A组：瑞芬太尼+甘氨酸组，B组：甘氨酸组；C组：瑞芬太尼+甘氨酸+氯胺酮组，D组：甘氨酸+氯胺酮组；E组：瑞芬太尼+甘氨酸+纳洛酮组，F组：甘氨酸+纳洛酮组。利用Western blot实验检测洗脱后1h、2h、4h、24hGluN1的GluN1和磷酸化GluN1（p-GluN1）。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试验揭示瑞芬太尼、氯胺酮、纳洛酮对GluN1mRNA的影响。结果: Western Blot实验发现GluN1A组四个时间点GluN1表达均明显少于B组（P<0.01），组内p-GluN1在4h和24h相比1h和2h明显增加（P<0.05）；A和B两组相比C、D组各自的GluN1数量减少更显著；EF两组在2、4、24hGluN1表达显著性差异。A组p-GluN1浓度则从1h开始缓慢增加在24h达到峰浓度；E组内p-GluN1在2h、4h、24h相比1h差异增加（P<0.05）。各组PCR的GluN1mRNA表达也呈现明显的时间依赖性，6组中加入瑞芬太尼后1、2、4、24hGluN1mRNA表达均明显减少（P<0.05），以4h和24h受抑制最明显；C、D两组则更明显，随时间延长对GluN1mRNA表达抑制一直持续至24h，且A、C两组相比随着氯胺酮的加入对GluN1mRNA表达抑制更加明显（P<0.05）；E、F两组除在2h对GluN1mRNA表达没有明显影响外，其余时间点仍显示对GluN1表达是抑制作用。结论:4nM瑞芬太尼使大鼠脊髓背角神经细胞膜上GluN1表达减少，GluN1磷酸化增加和抑制GluN1mRNA表达是其内向电流增加的分子基础，呈现时间依赖特点。μ受体在GluN1亚基激活中发挥了重要作用，磷酸化GluN1表达增加是OIH的相关分子机制之一。第三部分PKC及CaMKII对瑞芬太尼暴露后脊髓GluN1亚基磷酸化的影响目的：研究急性瑞芬太尼暴露对大鼠脊髓背角神经元PKC及CaMKII表达的影响以及PKC及CaMKII对脊髓NMDA受体GluN1亚基磷酸化的影响。方法：原代培养大鼠脊髓背角神经细胞，经4nm浓度瑞芬太尼60min后洗脱，立即和间隔1h测定PKC和CaMKII表达，并分别加入50和100μmo/L的KN93和Chelerythrine作用30min后，利用Westernblotting分别测定瑞芬太尼作用60min和120min后的GluN1和磷酸化GluN1（p-GluN1）表达。结果：4nm瑞芬太尼作用大鼠脊髓背角神经元1h后PKC浓度明显增加并持续至2h（P<0.05），CaMKII浓度1h变化不明显，2h开始增加。2hPKC浓度开始下降CaMKII浓度上升。GluN1变化时间表达逐渐减少，但无显著性差异；p-GluN1则随时间表达逐渐增强。A1组和A2组加入KN93后再测定p-GluN1， A1组显著降低（0.42vs0.21；P<0.05），A2组（0.49vs0.33；P<0.05），KN93拮抗CaMKII后GluN1的磷酸化明显受抑制。B1组和B2组加入chelerythrine作用1h后再测定p-GluN1，B1组显著降低（0.42vs0.26；P<0.05），B2组（0.49vs0.36；P<0.05），加入chelerythrine后GluN1的磷酸化明显受抑制。结论：PKC和CaMKII参与了GluN1的磷酸化，由PKC介导GluN磷酸化是急性OIH起始的因素，而由CaMKII介导的磷酸化是OIH维持的主要原因；选择性抑制PKC或CaMKII是治疗OIH的靶点。