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第一部分、SERT抑制剂氟西汀对血小板的作用 目的:通过检测氟西汀对血小板聚集、释放的影响,确定其对血小板功能的影响。 方法:采用血小板聚集检测仪与流式细胞仪观察不同浓度的氟西汀对血小板聚集、释放功能的影响。 结果:氟西汀能显著性的抑制低剂量胶原诱导的小鼠和人的洗涤血小板聚集,以及低剂量胶原诱导的人PRP聚集,并呈剂量依赖性,但对高剂量胶原诱导的小鼠洗涤血小板以及人富血小板血浆聚集无影响;氟西汀能显著的抑制胶原刺激的小鼠洗涤血小板P-selectin表达和ATP释放。 结果如下:①溶媒组、0.1μM、1μM和10μM氟西汀组对低剂量胶原刺激的小鼠洗涤血小板聚集率分别是64.30±7.79%、48.20±8.04%、34.50±6.34%和11.50±13.53%,而对高剂量胶原诱导的小鼠洗涤血小板聚集影响微弱。②溶媒组、0.1μM、1μM和10μM氟西汀组对人洗涤血小板低剂量胶原诱导的聚集率分别为59.57±3.90%、47.14±6.16%、27.86±5.50%和10.57±3.54%;此外,氟西汀明显抑制低剂量胶原诱导的人PRP聚集,并不影响高剂量胶原诱导的人PRP聚集。③氟西汀能显著抑制胶原刺激的血小板P-selectin的表达与ATP释放。 结论:氟西汀能剂量依赖性地抑制低剂量胶原诱导的血小板聚集,还能显著地抑制胶原刺激的血小板α颗粒与致密颗粒的释放。 第二部分、氟西汀对血小板内信号通路的影响 目的:通过检测氟西汀对小鼠和人血小板内信号蛋白分子的磷酸化的影响,分析SERT对血小板功能的影响的机制。 方法:洗涤血小板孵育氟西汀后,给予胶原刺激血小板活化,裂解细胞,采用Western Blot技术检测Akt(Ser473/474)、GSK3β(S9)和ERK1/2(E4)、p38 MAPK(T180/Y182)的磷酸化表达。 结果:10μM氟西汀能明显地抑制胶原刺激的Akt(Ser473/474)与其下游GSK3β(S9)磷酸化,对ERK1/2(E4)的磷酸化影响也较强,同时对小鼠的p38 MAPK(T180/Y182)的磷酸化没有影响,但对人的p38 MAPK却有轻微抑制作用。 结论:氟西汀可能作用于SERT,从而通过调控血小板PI3K/Akt信号通路发挥抑制血小板功能的作用。 第三部分、5-HT类似物对血小板及其信号通路的作用 目的:通过加入5-HT类似物与5-HT2受体阻断剂酮色林,检测小鼠血小板聚集与胞内信号蛋白分子的磷酸化水平,确定SERT对血小板功能的影响。 方法:洗涤血小板预孵育氟西汀或酮色林后,再孵育5-HT类似物,给予胶原相关肽刺激血小板活化,观察聚集并裂解细胞,采用Western Blot技术检测Akt(Ser473/474)、GSK3β(S9)和ERK1/2(E4)、p38 MAPK(T180/Y182)的磷酸化表达。 结果:10μM氟西汀能明显的抑制胶原相关肽刺激的血小板聚集和Akt(Ser473/474)与其下游GSK3β(S9)、ERK1/2(E4)和p38 MAPK(T180/Y182)的磷酸化,但是给予孵育5-HT类似物能显著对抗氟西汀对聚集与蛋白磷酸化的抑制作用,而酮色林不能完全取消5-HT类似物的作用。 结论:5-HT类似物可能作用于SERT,从而产生对抗氟西汀作用的作用。