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目的:利用RNAi技术沉默人肺腺癌A549细胞株STAT3基因,Western blot检测对STAT3、CyclinD1、Bcl-2、BAX、Caspase-9蛋白表达的影响及其相关性分析。方法:1.根据siRNA的设计原则,设计并采用化学合成法合成STAT3siRNA1、STAT3siRNA2、STAT3siRNA3,以脂质体介导下稳定转染人肺腺癌细胞系A549细胞(si-h-RNA组)作为研究对象,以转染si-h-RNA-Ncontrol A549细胞为阴性对照组,以未转染A549细胞作为空白对照组。于转染16h后荧光显微镜观察转染情况,通过将照片进行图像分析,观察转染效率。2.常规PCR检测RNA干扰的效率:于转染24h收集细胞,提取RNA后逆转录成cDNA,以靶基因STAT3为目的基因、管家基因β–actin为内参基因,设计引物进行扩增,将扩增产物琼脂糖凝胶电泳,检测目的条带及干扰效率。3.裂解细胞提取蛋白:在每瓶细胞中加入50ul细胞裂解液,用枪尖吹打混匀,冰上裂解30min,离心4oC, 12000 rpm×20min ,收集上清蛋白。4.蛋白免疫印迹法(Western-blot):选择干扰效率最高的STAT3siRNA2组为实验组,分别检测si-h-RNA组、阴性对照组、空白对照组中STAT3,CyclinD1, BAX , Bcl-2, Caspase-9蛋白表达:用BCA试剂盒测定样品总蛋白浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、考马斯亮蓝染色观察蛋白条带、电转移(electrotransfer)、封闭PVDF膜、免疫反应(加入一抗和二抗)、化学发光显示目的条带。5.图像分析:计算机扫描蛋白质条带, Image-Proplus图像分析软件进行分析。以蛋白条带的灰度值代表蛋白的表达量,用β-actin条带灰度值进行校正后代表蛋白相对表达水平,每个样本至少重复三次。分析si-h-RNA组、阴性对照组、空白对照组中STAT3蛋白与CyclinD1, Bcl-2, BAX , Caspase-9蛋白表达的差异及相关性。结果:(1)si-h-RNA组STAT3、CyclinD1、, Bcl-2蛋白的表达水平均明显低于阴性组和空白组,而BAX ,Caspase-9蛋白的表达水平均高于阴性组和空白组。前组分别与后两组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)后两组比较差异无统计学意义。(2)经Person相关性分析显示:RNAi后人肺腺癌细胞A549中STAT3与CyclinD1蛋白表达呈正相关(P<0.05);STAT3与Bcl-2蛋白表达呈正相关(P<0.05); STAT3与BAX蛋白表达程负相关性(P<0.05); STAT3与Caspase-9蛋白表达程无相关性(P>0.05)。结论:1.成功合成STAT3 siRNA,并将其成功转染入真核细胞中,能特异性下调STAT3mRNA及STAT3蛋白的表达,有效抑制肺癌细胞的增殖,诱导细胞凋亡。2. CyclinD1、Bcl-2蛋白在RNAi后表达强度均明显下降,通过实验证明其与STAT3的表达呈正相关,提示CyclinD1与STAT3、Bcl-2与STAT3之间存在着协同作用,沉默STAT3可抑制其下游基因CyclinD1、Bcl-2的表达,抑制肿瘤细胞生长,诱导肿瘤细胞凋亡,对抑制细胞恶性转化有重要作用。3. BAX与Caspase-9蛋白在RNAi后表达强度均明显增高,BAX与STAT3呈负相关,Caspase-9与STAT3无相关性,提示STAT3可能负调节BAX,降低Bcl-2/BAX比例而抑制细胞生长,促进细胞凋亡,而Caspase-9可能不参与STAT3信号转导途径,另有其他途径激活Caspase-9,或STAT3信号转导途径与其他信号转导途径共同激活Caspase-9。