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引言
宫颈癌在女性妇科生殖道恶性肿瘤中发生率位居第二位，女性恶性肿瘤中死亡率位居第三位，其中全球大约90％的宫颈癌死亡事件在发展中国家发生[1]。仅在2015年中国宫颈癌的新发病例估计在98900例，死亡人数30500例[2]。而宫颈癌前病变的筛查方法导致的漏诊，便是导致宫颈癌的发病率不断升高的主要原因之一[3]。因此对于宫颈癌的预防及治疗显得尤为重要。
研究显示在接近90%的宫颈上皮内瘤变和99.7%的子宫颈癌组织中发现有高危型HPV感染，其中约70%与HPV16型和18型相关[4,5]。高危型HPV（High-riskHumanPapillomavirus,hr-HPV）导致宫颈癌的发生发展过程成为了重要的研究方向。有研究指出高危型HPV能够诱导中、末分化阶段细胞中的DNA合成，导致遗传基因受损，发展成肿瘤[6,7]。宫颈癌的筛查由以往的细胞学检测转变为以HPV为基础的分子学检测[8]。临床研究证实HPV初筛具有更高的灵敏度和更好的阴性预测值，相对细胞学检查更加有效[9,10]。由于细胞学医师严重缺乏，尤其是发展中国家，宫颈癌的筛查手段停留在HPVDNA的检测手段[11]。但临床发现部分宫颈癌前病变及宫颈癌患者hr-HPV为阴性，仅依靠HPV检测容易漏诊。有学者提出hr-HPV阴性宫颈癌是某种特殊宫颈癌亚型[12]；还有学者认为宫颈病变是由HPV以外的病因所致[13]。那么寻找区别于HPV之外，识别宫颈癌的特异性肿瘤分子标志物，具有重要意义。有学者[14,15]指出，DNA甲基化检测技术用于诊断宫颈病变，在能够保持诊断的灵敏度的同时，也能提高特异性。TAFA基因家族中具有序列相似性的19家族（趋化因子（C-Cmotif）-样）成员A4（familywithsequencesimilarity19memberA4，FAM19A4）一经发现便受到了国内外学者的广泛关注，国外有学者研究[16]发现FAM19A4基因启动子甲基化能识别宫颈癌及其癌前病变，有望成为新型肿瘤标记物。在本课题组前期研究[17]发现，FAM19A4基因甲基化在正常宫颈及hr-HPV阳性宫颈癌石蜡组织中的检出率有明显的区别，推测FAM19A4基因甲基化是宫颈癌发生的早期事件，可用于二者的诊断。为探讨FAM19A4基因甲基化能否能独立于目前的HPV检测方法之外，运用于hr-HPV阴性宫颈癌的检测，对现有的宫颈癌筛查手段进行补充，以减少hr-HPV阴性宫颈癌的漏诊。本文采用双探针荧光定量PCR（Taqmanprobe-basedquantitativePCR，qPCR）技术，从hr-HPV阴性宫颈癌患者和hr-HPV阳性宫颈癌患者的病理石蜡包埋标本中，检测其中FAM19A4基因启动子甲基化情况，并比较hr-HPV阴性及阳性宫颈癌的不同临床病理特征中的差异，分析该基因甲基化在hr-HPV阴性宫颈癌中的诊断价值。
研究目的
使用不同检测方法验证hr-HPV阴性宫颈癌的真实HPV感染情况，探讨FAM19A4基因启动子甲基化用于诊断hr-HPV阴性宫颈癌的临床价值。
方法
收集2013年6月至2017年12月在广东省妇幼保健院妇科治疗的宫颈癌患者共490例，从其中筛选出术前宫颈刷液荧光定量PCR检测HPV结果为hr-HPV阴性的患者共25例，从术后石蜡样本中提取DNA依次经荧光定量PCR、HC-II重新检测，结果仍为hr-HPV阴性的样本为实验组；再从中选取3例hr-HPV阳性宫颈癌提取术后石蜡标本中的DNA样本经同样检测方法检测，结果为hr-HPV阳性的样本作为对照组；将实验组及对照组行高通量靶向测序再次检测HPV型别，并评估hr-HPV阴性及阳性宫颈癌的不同临床病理特征中的差异，进一步检测标本中FAM19A4基因甲基化的表达情况。
统计学方法
通过EXCEL表格将实验样本经过三种检测方式检测的结果进行初步统计，使用荧光定量PCR技术检测样本中FAM19A4基因的甲基化情况，并绘制扩增曲线，对比hr-HPV阴性及阳性宫颈癌患者FAM19A4基因的甲基化水平，通过EXCEL表格将hr-HPV阴性及阳性宫颈癌患者的病例资料进行初步统计，回顾性分析hr-HPV阴性及阳性宫颈癌患者的临床分期、组织病理及淋巴转移情况，采用SPSS23.0软件进行统计学分析，计数资料采用Pearson卡方检验或连续校正或Fisher精确概率法，α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.25例术后石蜡样本中经荧光定量PCR及HC-II方法检测结果为hr-HPV阴性共12例(48.0%，12/25)。将12例样本进行高通量测序，仍为阴性有9例（36%，9/25）。
2.经3种检测方法重复检测仍为hr-HPV阴性宫颈癌标本的FAM19A4基因甲基化检出率为100%（9/9）。
3.Hr-HPV阴性宫颈癌与hr-HPV阳性宫颈癌相比，在组织病理学有统计学差异（P＜0.05）；临床分期中hr-HPV阴性与阳性患者的构成分别比较，差异没有统计学意义(P＞0.05)；淋巴转移情况中hr-HPV阴性与阳性患者的构成分别比较，差异没有统计学意义(P＞0.05)。
结论
1.Hr-HPV阴性宫颈癌可能是一种相对hr-HPV阳性宫颈癌，临床病理特征较为特殊的宫颈癌；
2.目前使用的通过荧光定量PCR及HC-II检测HPV的方法都可能存在一定的假阴性率，经过更加敏感的检测方法检测后，hr-HPV阴性宫颈癌真实发病率将进一步下降；
3.FAM19A4基因启动子可能是宫颈癌的一种新的肿瘤标记物，结合FAM19A4基因启动子甲基化的检测将对hr-HPV阴性宫颈癌的诊断可能有重要的辅助意义。
宫颈癌在女性妇科生殖道恶性肿瘤中发生率位居第二位，女性恶性肿瘤中死亡率位居第三位，其中全球大约90％的宫颈癌死亡事件在发展中国家发生[1]。仅在2015年中国宫颈癌的新发病例估计在98900例，死亡人数30500例[2]。而宫颈癌前病变的筛查方法导致的漏诊，便是导致宫颈癌的发病率不断升高的主要原因之一[3]。因此对于宫颈癌的预防及治疗显得尤为重要。
研究显示在接近90%的宫颈上皮内瘤变和99.7%的子宫颈癌组织中发现有高危型HPV感染，其中约70%与HPV16型和18型相关[4,5]。高危型HPV（High-riskHumanPapillomavirus,hr-HPV）导致宫颈癌的发生发展过程成为了重要的研究方向。有研究指出高危型HPV能够诱导中、末分化阶段细胞中的DNA合成，导致遗传基因受损，发展成肿瘤[6,7]。宫颈癌的筛查由以往的细胞学检测转变为以HPV为基础的分子学检测[8]。临床研究证实HPV初筛具有更高的灵敏度和更好的阴性预测值，相对细胞学检查更加有效[9,10]。由于细胞学医师严重缺乏，尤其是发展中国家，宫颈癌的筛查手段停留在HPVDNA的检测手段[11]。但临床发现部分宫颈癌前病变及宫颈癌患者hr-HPV为阴性，仅依靠HPV检测容易漏诊。有学者提出hr-HPV阴性宫颈癌是某种特殊宫颈癌亚型[12]；还有学者认为宫颈病变是由HPV以外的病因所致[13]。那么寻找区别于HPV之外，识别宫颈癌的特异性肿瘤分子标志物，具有重要意义。有学者[14,15]指出，DNA甲基化检测技术用于诊断宫颈病变，在能够保持诊断的灵敏度的同时，也能提高特异性。TAFA基因家族中具有序列相似性的19家族（趋化因子（C-Cmotif）-样）成员A4（familywithsequencesimilarity19memberA4，FAM19A4）一经发现便受到了国内外学者的广泛关注，国外有学者研究[16]发现FAM19A4基因启动子甲基化能识别宫颈癌及其癌前病变，有望成为新型肿瘤标记物。在本课题组前期研究[17]发现，FAM19A4基因甲基化在正常宫颈及hr-HPV阳性宫颈癌石蜡组织中的检出率有明显的区别，推测FAM19A4基因甲基化是宫颈癌发生的早期事件，可用于二者的诊断。为探讨FAM19A4基因甲基化能否能独立于目前的HPV检测方法之外，运用于hr-HPV阴性宫颈癌的检测，对现有的宫颈癌筛查手段进行补充，以减少hr-HPV阴性宫颈癌的漏诊。本文采用双探针荧光定量PCR（Taqmanprobe-basedquantitativePCR，qPCR）技术，从hr-HPV阴性宫颈癌患者和hr-HPV阳性宫颈癌患者的病理石蜡包埋标本中，检测其中FAM19A4基因启动子甲基化情况，并比较hr-HPV阴性及阳性宫颈癌的不同临床病理特征中的差异，分析该基因甲基化在hr-HPV阴性宫颈癌中的诊断价值。
研究目的
使用不同检测方法验证hr-HPV阴性宫颈癌的真实HPV感染情况，探讨FAM19A4基因启动子甲基化用于诊断hr-HPV阴性宫颈癌的临床价值。
方法
收集2013年6月至2017年12月在广东省妇幼保健院妇科治疗的宫颈癌患者共490例，从其中筛选出术前宫颈刷液荧光定量PCR检测HPV结果为hr-HPV阴性的患者共25例，从术后石蜡样本中提取DNA依次经荧光定量PCR、HC-II重新检测，结果仍为hr-HPV阴性的样本为实验组；再从中选取3例hr-HPV阳性宫颈癌提取术后石蜡标本中的DNA样本经同样检测方法检测，结果为hr-HPV阳性的样本作为对照组；将实验组及对照组行高通量靶向测序再次检测HPV型别，并评估hr-HPV阴性及阳性宫颈癌的不同临床病理特征中的差异，进一步检测标本中FAM19A4基因甲基化的表达情况。
统计学方法
通过EXCEL表格将实验样本经过三种检测方式检测的结果进行初步统计，使用荧光定量PCR技术检测样本中FAM19A4基因的甲基化情况，并绘制扩增曲线，对比hr-HPV阴性及阳性宫颈癌患者FAM19A4基因的甲基化水平，通过EXCEL表格将hr-HPV阴性及阳性宫颈癌患者的病例资料进行初步统计，回顾性分析hr-HPV阴性及阳性宫颈癌患者的临床分期、组织病理及淋巴转移情况，采用SPSS23.0软件进行统计学分析，计数资料采用Pearson卡方检验或连续校正或Fisher精确概率法，α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.25例术后石蜡样本中经荧光定量PCR及HC-II方法检测结果为hr-HPV阴性共12例(48.0%，12/25)。将12例样本进行高通量测序，仍为阴性有9例（36%，9/25）。
2.经3种检测方法重复检测仍为hr-HPV阴性宫颈癌标本的FAM19A4基因甲基化检出率为100%（9/9）。
3.Hr-HPV阴性宫颈癌与hr-HPV阳性宫颈癌相比，在组织病理学有统计学差异（P＜0.05）；临床分期中hr-HPV阴性与阳性患者的构成分别比较，差异没有统计学意义(P＞0.05)；淋巴转移情况中hr-HPV阴性与阳性患者的构成分别比较，差异没有统计学意义(P＞0.05)。
结论
1.Hr-HPV阴性宫颈癌可能是一种相对hr-HPV阳性宫颈癌，临床病理特征较为特殊的宫颈癌；
2.目前使用的通过荧光定量PCR及HC-II检测HPV的方法都可能存在一定的假阴性率，经过更加敏感的检测方法检测后，hr-HPV阴性宫颈癌真实发病率将进一步下降；
3.FAM19A4基因启动子可能是宫颈癌的一种新的肿瘤标记物，结合FAM19A4基因启动子甲基化的检测将对hr-HPV阴性宫颈癌的诊断可能有重要的辅助意义。