研究背景随着透析技术日臻成熟,慢性肾功能衰竭(chronic renal failure, CRF)病人因尿毒症致死者日益减少,目前导致这类病人死亡的主要原因是CRF和透析的各类并发症,心血管病是其中最重要的致死性并发症。CRF病人动脉粥样硬化的发生率是同年龄一般人群的10-20倍,且发病年龄提前至35-45岁,被称之为“加速性动脉粥样硬化”(accelerated atherosclerosis)。CRF患者动脉粥样硬化快速发生、发展的原因目前尚未阐明,但一般推测与两方面因素有关：(1)CRF往往合并高血压、高脂血症、糖尿病等已被证实是一般人群中促发心血管病的危险因素(传统危险因素)；(2)CRF病人还合并一些与尿毒症有关的可能促发心血管病的因素,包括贫血、二价离子代谢紊乱、微炎症状态等(尿毒症相关的危险因素)。CRF时由于代谢紊乱,循环和组织中有多种糖和蛋白质代谢终产物潴留。晚期糖基化终产物(advanced glycation end products, AGE)和晚期蛋白氧化产物(advanced oxidation protein products, AOPP)是蛋白质被糖化/氧化修饰后的产物,在CRF患者体内异常升高,其水平与动脉粥样硬化的发病率呈正相关。本实验室近期用动物研究直接证实了AGE和AOPP修饰的蛋白对动脉粥样硬化的促进作用,国内外学者在进一步的体外实验研究中发现,AGE/AOPP修饰蛋白具有促发细胞炎症反应的作用。体内实验已证实AGE修饰的血清白蛋白,可显著促进动脉粥样斑块的形成,斑块部位血管内膜下的炎症细胞浸润显著增强。这些结果提示AGE/AOPP修饰蛋白可能参与了动脉粥样硬化发展过程中的急性炎症阶段,促进白细胞通过血管内皮屏障迁移至内膜下(transendothelial migration, TEM)。TEM过程中,细胞骨架发生重组和再分布,形成应力纤维,最终导致细胞间隙增大,形成细胞旁通路；与此同时,内皮细胞膜表面的粘附分子重新分布,聚集在细胞表面的微突起、微绒毛等部位,引导活化的白细胞穿过细胞旁通路。而胞浆内细胞骨架重组和膜表面粘附分子重新分布均受埃兹蛋白、根蛋白、膜突蛋白(ezrin-radixin-moesin,ERM)蛋白家族的控制和协调。ERM蛋白一般处于非活化、非磷酸化状态,活化的ERM蛋白N端和粘附分子在胞内结合,C端和细胞骨架F-肌动蛋白结合,成为链接细胞表面粘附分子与胞浆内细胞骨架的“桥梁”。有研究表明,ERM蛋白同小GTP结合蛋白家族Rho/Rac信号通路的作用介导了细胞骨架和粘附分子的重新分布,提示ERM蛋白同Rho/Rac信号通路在TEM过程中发挥了重要的作用,但它们间的作用机制目前尚不清楚。综上,AGE/AOPP可能参与了“加速性动脉粥样硬化”发展过程中的急性炎症阶段,促进白细胞通过血管内皮屏障迁移至内膜下。而ERM是介导TEM过程的关键分子,那么AGE/AOPP是否参与了对ERM蛋白活化的调控及其可能存在的机制,目前尚不清楚。本研究旨在观察AGE和AOPP修饰蛋白对人血管内皮细胞Ezrin活化的调控,并对上述作用的细胞内信号转导通路及分子机制进行探讨。研究方法一、AGE-HSA(human serum albumin)和AOPP-HSA的制备1.体外制备无内毒素AGE-HSA按文献方法体外制备无内毒素AGE-HSA。将1.75g/L纯化的HSA分别置于含或不含0.1mol/L D-葡萄糖的0.4M磷酸盐缓冲液中,37℃孵育8周;用pH7.4磷酸盐缓冲液透析以去除葡萄糖。以在同样条件但不含葡萄糖的缓冲液中孵育8周的HSA作为对照。用0.22μm的微孔滤膜过滤消毒。2.体外制备无内毒素AOPP-HSA将20mg/ml HSA与40mmol/l次氯酸等体积混合,室温放置30分钟,其摩尔比为1：140(HSA：次氯酸)。制备的AOPP-HSA在无内毒素PBS中透析24小时,除去游离的次氯酸。用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后4℃保存。20mg/ml HSA与PBS等体积混合作为对照。AOPP-HSA含量通过测定酸性条件下340nm的光吸收,以氯胺T为标准取得。二、细胞培养1、人脐静脉内皮细胞的分离与培养分离培养人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs):无菌条件下,取20-35cm新鲜人脐带(4℃保存不超过12小时),剪去两端各0.5cm,在脐静脉一端插入16号针头并固定,用温PBS灌洗3次至流出液清亮,用止血钳夹住脐带的另一端,灌入0.25%胰蛋白酶0.016%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)消化液约8-15ml至脐静脉充盈,于37℃孵育7-9分钟,轻揉脐带,将消化液收集入50ml离心管,用PBS冲洗一遍,一并收入离心管中,离心沉淀(1000rpm)10分钟,弃上清,再用含15%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的RPMI 1640培养液混匀细胞沉渣,调整细胞浓度至1.5-2.0×104/cm2种入培养瓶中,在37℃、5%CO2条件下培养。次日换液,除去未贴壁细胞,以后根据细胞生长情况每2-3日换液一次。用原代或第二代细胞进行实验。2、THP-1细胞的复苏、培养人THP-1单核细胞采用美国ATCC细胞株,复苏后在在37℃、5%CO2条件下含10%FBS的RPMI 1640培养液培养。实验前改换用无血清RPMI 1640培养液继续培养24小时,然后用于检测内皮细胞的通透性。三、AGE/AOPP修饰白蛋白对Rho活性的影响1.AGE-HSA对Rho活性的影响观察AGE-HSA对Rho活性影响的剂量效应：HUVECs分别与25、50、100μg/ml AGE-HSA或100μg/ml未经修饰的HSA共同孵育5min,然后收集细胞总蛋白。观察AGE-HSA对Rho活性影响的时间效应：HUVECs与100μg/ml AGE-HSA或100μg/ml未经修饰的HSA共同孵育0、2、5、10及15min,然后收集细胞总蛋白。利用沉降法、Western Blotting检测Rho GTP,反映Rho的活性。阻断试验中,HUVECs与100μg/ml anti-RAGE预孵育1小时,用100μg/ml AGE-HSA刺激5min,然后收集细胞总蛋白。利用沉降法、Western Blotting检测Rho GTP,观察抗RAGE抗体对AGE-HSA所致Rho活性的影响。2.AOPP-HSA对Rho活性的影响观察AOPP-HSA对Rho活性影响的剂量效应：HUVECs与50、100、200μg/ml AOPP-HSA或200μg/ml未经修饰的HSA共同孵育5min,然后收集细胞总蛋白。观察AOPP-HSA对Rho活性影响的时间效应：HUVECs与200μg/mlAOPP-HSA或200μg/ml未经修饰的HSA共同孵育0、2、5、10及15min,然后收集细胞总蛋白。利用沉降法、Western Blotting检测]Rho GTP,反映Rho的活性。阻断试验中,HUVECs与100μg/ml anti-RAGE预孵育1小时,用200μg/ml AOPP-HSA刺激5min,然后收集细胞总蛋白。利用沉降法、Western Blotting检测Rho GTP,观察抗RAGE抗体对AOPP-HSA所致Rho活性的影响。四、AGE/AOPP修饰白蛋白对Rho激酶(Rho kinase,ROCK)活性的影响1.AGE-HSA对ROCK活性的影响观察AGE-HSA对ROCK活性影响的剂量效应：HUVECs与25、50、100μg/ml AGE-HSA或100μg/ml HSA共同孵育10min,然后收集细胞总蛋白。观察AGE-HSA对ROCK活性影响的时间效应：HUVEC与100μg/ml AGE-HSA或相同浓度的HSA共同孵育0、5、10、15及30min,然后收集细胞总蛋白。Western Blotting检测肌球蛋白轻链(phosph-myosin light chain,p-MLC, ROCK的经典作用底物)的磷酸化水平表达,反映ROCK的活性。2.AOPP-HSA对ROCK活性的影响观察AOPP-HSA对ROCK活性影响的剂量效应：HUVECs与50、100、200μg/ml AOPP-HSA或200μg/ml HSA共同孵育10min,然后收集细胞总蛋白。观察AOPP-HSA对ROCK活性影响的时间效应：HUVECs与200μg/ml AOPP-HSA或相同浓度的HSA共同孵育0、5、10、15及30min,然后收集细胞总蛋白。Western Blotting检测MLC的磷酸化水平,反映ROCK的活性。3.抑制剂对AGE-/AOPP-HSA所导ROCK活性的影响在阻断试验中,细胞分别与anti-RAGE (100μg/ml)、ROCK抑制剂Y27632(30μM)预孵育1小时,用100μg/ml AGE-HSA或200μg/ml AOPP-HSA刺激10min,然后收集细胞总蛋白。Western Blotting检测MLC的磷酸化水平,观察抗RAGE抗体、Y27632对AGE-/AOPP-HSA所致ROCK活性的影响。五、AGE/AOPP修饰白蛋白对NADPH氧化酶活性的影响1.AGE-HSA对NADPH氧化酶活性的影响观察AGE-HSA对NADPH氧化酶活性影响的剂量效应：HUVECs与25、50、100μg/ml AGE-HSA或100μg/ml HSA共同孵育15min,然后收集细胞总蛋白。免疫沉淀、Western Blotting检测磷酸化-丝氨酸(phosph-serine,p-serine)、p47phox蛋白含量。2.AOPP-HSA对NADPH氧化酶活性的影响观察AOPP-HSA对NADPH氧化酶活性影响的剂量效应：HUVECs与50、100、200μg/ml AOPP-HSA或200μg/ml HSA共同孵育15min,然后收集细胞总蛋白。免疫沉淀、Western Blotting检测p-serine、p47phox蛋白含量。3.抑制剂对AGE-/AOPP-HSA所致NADPH氧化酶活性的影响在阻断试验中,细胞分别与anti-RAGE (100μg/ml)、Y27632(30μM) NADPH氧化酶抑制剂]DPI(100μM)预孵育1小时,用100μg/ml AGE-HSA或200μg/ml AOPP-HSA刺激15min,然后收集细胞总蛋白。免疫沉淀、Western Blotting检测p-serine、p47phox蛋白含量,观察抗RAGE抗体、Y27632、DPI对AGE-/AOPP-HSA所致NADPH氧化酶活性的影响。六、AGE/AOPP修饰白蛋白对ezrin活性的影响1.AGE-HSA对ezrin活性的影响(1)观察AGE-HSA对ezrin活性影响的剂量效应：HUVECs与25、50、100μg/ml AGE-HSA或100μg/ml HSA共同孵育15min,然后收集细胞总蛋白。观察AGE-HSA对ezrin活性影响的时间效应：HUVECs与100μg/ml AGE-HSA或相同浓度的HSA共同孵育0、5、10、15及30min,然后收集细胞总蛋白。Western Blotting检测p-ezrin、ezrin蛋白含量。(2)免疫荧光法观察p-ezrin在细胞内的分布。2.AOPP-HSA对ezrin活性的影响(1)观察AOPP-HSA对ezrin活性影响的剂量效应：HUVECs与50、100、200μg/ml AOPP-HSA或200μg/ml HSA共同孵育15min收集,然后细胞总蛋白。观察AOPP-HSA对ezrin影响的时间效应：HUVECs与200μg/ml AOPP-HSA或相同浓度的HSA共同孵育0、5、10、15及30min,然后收集细胞总蛋白。Western Blotting检测p-ezrin、ezrin蛋白含量。(2)免疫荧光法观察p-ezrin在细胞内的分布。3.抑制剂对AGE-/AOPP-HSA导致的ezrin活性的影响在阻断试验中,细胞分别与anti-RAGE (100μg/ml)、Y27632 (30μM) DPI (100μM)、胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)抑制剂PD98059(10μM)及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)P38抑制剂SB203580 (10μM)预孵育1小时,用100μg/ml AGE-HSA或200μg/ml AOPP-HSA,收集细胞总蛋白。Western Blotting检测p-ezrin、ezrin蛋白含量,观察抗RAGE抗体、Y27632、DPI、PD98059、SB203580对AGE-/AOPP-HSA所致ezrin活性的影响。七、细胞骨架重构的观察、内皮细胞通透性的检测1.细胞骨架重构的观察HUVECs分别与100μg/ml AGE-HSA或相同浓度的HSA共同孵育8h,用罗丹明-鬼笔环肽染F-肌动蛋白(F-actin),免疫荧光显微镜观察应力纤维的形成。阻断试验中,HUVECs分别与anti-RAGE (100μg/ml)、Y27632 (30μM)、DPI(100μM)预孵育1小时,加入100μg/ml AGE-HSA共同孵育8h,用罗丹明-鬼笔环肽染F-肌动蛋白(F-actin),观察应力纤维的形成。HUVECs分别与200μg/ml AOPP-HSA或相同浓度的HSA共同孵育8h,用罗丹明-鬼笔环肽染F-肌动蛋白(F-actin),免疫荧光显微镜观察应力纤维的形成。阻断试验中,HUVECs分别与anti-RAGE(100μg/ml)、Y27632(30μM)、DPI (100μM)预孵育1小时,加入200μg/ml AOPP-HSA共同孵育8h,用罗丹明-鬼笔环肽染F-肌动蛋白(F-actin),观察应力纤维的形成。2.内皮细胞通透性的检测Transewell模型检测内皮细胞的通透性,接种于inserts的HUVECs分别与100μg/ml AGE-HSA或相同浓度的HSA共同孵育8小时后,加入用无血清的RPMI1640悬浮的THP-1细胞,3小时后,收集下室的THP-1细胞,检测蛋白含量,反映穿过单层内皮细胞屏障的数目。阻断试验中,接种于小室的HUVECs分别与anti-RAGE (100μg/ml)、Y27632 (30μM)、DPI(100μM)预孵育1小时,加入100μg/ml AGE-HSA共同孵育8h,加入用无血清的RPMI 1640悬浮的THP-1细胞,3小时后,收集下室的THP-1细胞,检测蛋白含量,反映穿过单层内皮细胞屏障的数目。接种于inserts的HUVECs分别与200μg/ml AOPP-HSA或相同浓度的HSA共同孵育8小时后,加入用无血清的RPMI 1640悬浮的THP-1细胞,3小时后,收集下室的THP-1细胞,检测蛋白含量,反映穿过单层内皮细胞屏障的数目。阻断试验中,接种于小室的HUVECs分别与anti-RAGE (100μg/ml)、Y27632 (30μM)、DPI (100μM)预孵育1小时,加入200μg/ml AOPP-HSA共同孵育8h,加入用无血清的RPMI 1640悬浮的THP-1细胞,3小时后,收集下室的THP-1细胞,检测蛋白含量,反映穿过单层内皮细胞屏障的数目。八、统计方法所有数据均代表3次重复实验的结果,以均数±标准差表示。所有统计由统计软件SPSS13.0完成。多个样本均数的比较采用One-Way ANOVA,两两比较采用LSD,P<0.05为差异有统计学意义。结果一、AGE-HSA和AOPP-HSA的鉴定1.AGE-HSA的鉴定：体外制备的修饰蛋白经荧光分光光度法鉴定,在激发波长365nm,吸收波长435nm测定制备的AGE-HSA中AGE的含量为123.194U/mg蛋白质,对照样本AGE含量为3.511U/mg蛋白质。所有制备的AGE-HSA或未经修饰的HSA经鲎试验法检测内毒素含量均低于0.25EU/ml。2AOPP-HSA的鉴定：制备的AOPP-HSA和未经修饰的HSA的蛋白浓度分别为9.4mg/ml和10.1mg/ml,AOPP含量分别为701μmol/l和1.55μmol/l,经蛋白浓度矫正后分别为72.7nmol/mg蛋白和0.14nmol/mg蛋白。所有制备的AOPP-HSA或未经修饰的HSA经鲎试验法检测内毒素含量均低于0.25EU/ml。二、AGE-/AOPP-HSA通过RAGE活化Rho1.AGE-HSA以剂量、时间依赖的方式活化RhoHUVECs分别与25、50、100μg/ml的AGE-HSA共同孵育5min,Rho的活性随AGE-HSA浓度的增加而升高,呈剂量依赖性(P<0.01)。HUVECs与100μg/ml AGE-HSA共同孵育0、2、5、10及15min,Rho的活性随AGE-HSA刺激时间的延长而升高,在5min时达高峰,呈时间依赖性(P<0.01)。而未经修饰的HSA对Rho的活性无明显作用(P>0.05)。阻断试验中,AGE-HSA诱导的Rho活性增加可被anti-RAGE明显抑制(P<0.01)。2.AOPP-HSA以剂量、时间依赖的方式活化RhoHUVECs分别与50、100、200μg/ml的AOPP-HSA共同孵育5min,Rho的活性随AOPP-HSA浓度的增加而升高,呈剂量依赖性(P<0.01)。HUVECs与200μg/ml AOPP-HSA共同孵育0、2、5、10及15min,Rho的活性随AOPP-HSA刺激时间的延长而升高,在5min时达高峰,呈时间依赖性(P<0.01)。而未经修饰的HSA对Rho的活性无明显作用(P>0.05)。阻断试验中,AOPP-HSA诱导的Rho活性增加可被anti-RAGE明显抑制(P<0.01)。三、AGE-/AOPP-HSA通过RAGE活化ROCK1.AGE-HSA以剂量、时间依赖的方式活化ROCKHUVECs分别与25、50、100μg/ml的AGE-HSA共同孵育10min,ROCK活性随AGE-HSA浓度的增加而升高,呈剂量依赖性(P<0.01)。HUVECs与100μg/ml AGE-HSA共同孵育0、5、10、15及30min,ROCK活性随AGE-HSA刺激时间的延长而升高,在10min时达高峰,呈时间依赖性(P<0.01)。而未经修饰的HSA对ROCK活性无明显作用(P>0.05)2.AOPP-HSA以剂量、时间依赖的方式活化ROCKHUVECs分别与50、100、200μg/ml的AOPP-HSA共同孵育10min,ROCK活性随AOPP-HSA浓度的增加而升高,呈剂量依赖性(P<0.01)。HUVECs与200μg/ml AOPP-HSA共同孵育0、5、10、15及30min,ROCK活性随AOPP-HSA刺激时间的延长而升高,在10min时达高峰,呈时间依赖性(P<0.01)。而未经修饰的HSA对ROCK活性无明显作用(P>0.05)3.抑制剂抑制AGE-/AOPP-HSA诱导的ROCK活性增加AGE-HSA或AOPP-HSA诱导的ROCK活性增加被anti-RAGE、Y27632明显抑制(P<0.01)。四、AGE-/AOPP-HSA通过RAGE、Rho/ROCK活化NADPH氧化酶1.AGE-HSA以剂量依赖的方式活化NADPH氧化酶HUVECs分别与25、50、100μg/ml的AGE-HSA共同孵育15min,p-serine的表达量随AGE-HSA浓度的增加而升高,呈剂量依赖性(P<0.01)；而未经修饰的HSA对NADPH氧化酶活化无明显作用(P>0.05)。2.AOPP-HSA以剂量依赖的方式活化NADPH氧化酶HUVECs分别与50、100、200μg/ml的AOPP-HSA共同孵育15min,p-serine的表达量随AOPP-HSA浓度的增加而升高,呈剂量依赖性(P<0.01)；而未经修饰的HSA对NADPH氧化酶活化无明显作用(P>0.05)3.抑制剂抑制AGE-/AOPP-HSA诱导的NADPH氧化酶活性的增加AGE-/AOPP-HSA诱导的p-serine的表达量的上调被anti-RAGE、Y27632、DPI明显抑制(P<0.01)。五、AGE-/AOPP-HSA通过RAGE、Rho/ROCK、NADPH氧化酶活化ezrin1.AGE-HSA以剂量、时间依赖的方式活化ezrinHUVECs分别与25、50、100μg/ml的AGE-HSA共同孵育15min,ezrin活性随AGE-HSA浓度的增加而升高,呈剂量依赖性(P<0.01)。HUVECs与100μg/ml AGE-HSA共同孵育0、5、10、15及30min,ezrin活性随AGE-HSA刺激时间的延长而升高,在15min时达高峰,呈时间依赖性(P<0.01)。而HSA对ezrin活性无明显作用(P>0.05)免疫荧光化学染色可见HUVECs的胞膜和胞浆均有p-ezrin的表达,基础状态下有少量p-ezrin的表达,100μg/ml AGE-HSA作用15min,p-ezrin的表达明显增高。2AOPP-HSA以剂量、时间依赖的方式活化ezrinHUVECs分别与50、100、200μg/ml的AOPP-HSA共同孵育15min,ezrin活性随AOPP-HSA浓度的增加而升高,呈剂量依赖性(P<0.01)。HUVECs与200μg/ml AOPP-HSA共同孵育0、5、10、15及30min,ezrin活性随AOPP-HSA刺激时间的延长而升高,在15min时达高峰,呈时间依赖性(P<0.01)。而HSA对ezrin活性无明显作用(P＞0.05)免疫荧光化学染色可见HUVECs的胞膜和胞浆均有p-ezrin的表达,基础状态下有少量p-ezrin的表达,200μg/ml AOPP-HSA作用15min,p-ezrin的表达明显增高。3.抑制剂抑制AGE-/AOPP-HSA诱导ezrin的活化AGE-HSA或AOPP-HSA诱导ezrin活性增加被anti-RAGE、Y27632、DPI明显抑制(P<0.01),而SB203580、PD98059未能抑制AGE-HSA或AOPP-HSA诱导的ezrin活性增加(P>0.05)六、AGE-/AOPP-HSA诱导内皮细胞骨架重构、内皮细胞通透性增加1.AGE-/AOPP-HSA诱导内皮细胞骨架重构免疫荧光显微镜观察发现AGE-HSA和AOPP-HSA组应力纤维的形成量明显高于对照组,而anti-RAGE、Y27632、DPI能够减少AGE-HSA和AOPP-HSA诱导的应力纤维形成。同时,未经修饰的HSA对应力纤维形成无明显作用。2.AGE-/AOPP-HSA诱导内皮细胞通透性增加Transewell模型检测内皮细胞的通透性,收集下室的THP-1细胞,检测蛋白含量,结果发现AGE-HSA和AOPP-HSA组下室的蛋白浓度明显高于对照组,而anti-RAGE、Y27632、DPI能够抑制AGE-HSA和AOPP-HSA诱导致内皮细胞通透性增加的效应(P<0.01)。同时,未经修饰的HSA对内皮细胞通透性无明显作用(P>0.05)。结论我们的研究证实,AGE-/AOPP-HSA以时间和剂量依赖的方式增加ezrin蛋白的活化,其途径主要通过受体RAGE的介导依次活化了Rho/ROCK、NADPH氧化酶、ezrin,最终导致内皮细胞的骨架重构及细胞的通透性增加。