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罗非鱼是我国重要的经济养殖鱼类,但近年来由于罗非鱼病害的大规模爆发,给罗非鱼产业造成严重威胁。链球菌是目前全球公认的感染罗非鱼最重要的病原体,尚未发现有效的防治措施。开展罗非鱼免疫相关基因的挖掘及其功能分析研究工作,解析罗非鱼的免疫调控机制,为下一步进行抗病相关标记的筛选,辅助抗病罗非鱼品种的选育奠定基础,对于罗非鱼链球菌病的防治工作具有潜在的应用价值。模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)对病原体的识别,是启动先天免疫反应的关键一步。Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是第一个被发现的模式识别受体,也被认为是机体抵抗病原微生物感染的关键受体。本实验克隆得到尼罗罗非鱼TLRs(TLR2、TLR3、TLR5、TLR13、TLR21、TLR22和TLR23)的c DNA序列全长,实时定量PCR检测其在各组织和器官及胚胎发育过程中的表达量以及感染链球菌后表达的变化;构建各基因真核表达载体,并研究鱼体中过表达TLRs对TLR信号通路下游基因表达的影响,以及哺乳动物细胞中过表达TLRs基因后,对NF-κB活性的影响;用克隆测序的方法分析TLR22和TLR23基因多态性以及该基因多态性与罗非鱼链球菌病抗性的关系,为罗非鱼抗病品系选育提供理论基础。主要结果和结论如下:1.尼罗罗非鱼TLRs基因cDNA的克隆与相关生物信息学分析采用同源克隆和c DNA末端快速扩增技术得到TLRs的c DNA序列,并用特异引物直接扩增法获得部分TLRs(TLR3、TLR21、TLR22和TLR23)基因组序列。尼罗罗非鱼TLR2(On TLR2)c DNA序列全长3677bp,其开放阅读框序列(ORF)为2670 bp,编码889个氨基酸残基;On TLR3基因全长为5662bp,包含4个外显子和3个内含子,其ORF为2739 bp,编码912个氨基酸残基;On TLR5基因c DNA序列全长3500bp,ORF为2664 bp,编码887个氨基酸残基;On TLR13基因c DNA序列全长3905bp,ORF为2835 bp,编码944个氨基酸残基;On TLR21基因c DNA序列全长3196bp(Gen Bank No.KJ010824),ORF为2940bp,编码979个氨基酸残基;On TLR22基因序列全长3440bp(Gen Bank No.KJ010825),包含3个外显子和2个内含子,ORF长2808bp,编码935个氨基酸残基;On TLR23基因序列全长3789bp,包含3个外显子和2个内含子,ORF长2817bp,编码938个氨基酸残基。2.尼罗罗非鱼TLRs基因的组织表达分析利用所得尼罗罗非鱼TLRs基因c DNA序列,设计特异性引物,运用实时定量PCR的方法检测TLRs基因m RNA在各组织或器官中的表达量;并分析其在罗非鱼胚胎发育过程中表达量的变化情况,以及用罗非鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalatiae)感染后,分析TLRs基因在各组织或器官中表达量的变化。定量PCR分析结果显示,TLRs在健康尼罗罗非鱼肾、脑、心脏、脾脏、鳃、肝脏、胃、肌肉、肠、血液和皮肤中均有表达,但不同TLRs在不同组织或器官的表达量有所差异。On TLR2在脑和胃中表达量最高,在肝脏中表达量最低;On TLR3在脾脏中表达量最高,在肝脏中表达量最低;On TLR5在血液中表达量最高,在肾脏中表达量最低;On TLR13在脾脏中表达量最高,在肝脏中表达量最低;On TLR21在鳃中的表达量最高,在肝脏中表达量最低;On TLR22在脾脏中表达量最高,在肝脏中表达量最低;On TLR23在血液中表达量最高,在胃中表达量最低。实时定量PCR分析TLRs基因在尼罗罗非鱼胚胎发育过程中(2.5 d、3.5 d、4.5 d、5 d、5.5 d、6 d、6.5 d、7.5 d和8.5 d)表达量变化,结果显示,胚胎发育过程中所检测的TLRs均有表达,不同的TLRs在胚胎发育过程中的表达变化情况不同,但均有上升趋势,且均在5d-6.5d达到峰值。无乳链球菌感染后,TLR2、TLR3、TLR5、TLR13和TLR21在所检测组织的表达量多数有明显的上调,而TLR22和TLR23在所检测组织的表达量均呈下调。3.罗非鱼鱼体内过表达TLRs基因后,对尼罗罗非鱼TLR信号通路相关下游基因表达影响本研究将pc DNA3.1/CT-GFP-TOPO?和构建的TLRs基因ORF真核表达载体肌肉注射健康罗非鱼体内,用PGN(20μg/尾)刺激目的基因过表达后,腹腔注射无乳链球菌(100μl),检测TLRs信号通路下游基因的表达谱。结果显示,On TLRs过表达后可使Myd88在肠和肝脏中的表达量大多数呈现上调趋势,而在脑中的表达量大多数呈现下调的趋势,On TLRs和On Myd88过表达后,TRAF3在肠中的表达量均显著上调,同样,TRAF6和TRF3在肠中的表达量多数呈现上调作用。4.哺乳动物细胞系中过表达尼罗罗非鱼TLRs基因对NF-κB活性的影响本研究为确定尼罗罗非鱼TLR2、TLR21、TLR22和TLR23对NF-κB活性的影响,分别成功构建了pc DNA3.1-TLR2、pc DNA3.1-TLR21、pc DNA3.1-TLR22、pc DNA3.1-TLR23和pc DNA3.1-Myd88真核表达载体。双荧光素酶报告基因分析显示:单一的pc DNA3.1-TLR2、pc DNA3.1-TLR21、pc DNA3.1-TLR22和 pc DNA3.1-TLRs与pc DNA3.1-Myd88真核表达载体共同瞬时转染于293T细胞时,可显著增强NF-κB活性。激光共聚焦显微镜观察发现On TLR2、On TLR21、On TLR22和On TLR23均定位于细胞膜上。pc DNA3.1-TLR23过表达于293 T细胞并不能使NF-κB活性增强,但5.TLRs基因与罗非鱼链球菌抗性的关系为了解TLR22和TLR23基因多态性与尼罗罗非鱼链球菌病抗性的相关关系,本研究用设计特异性引物,分别从尼罗罗非鱼20个家系的20尾感病个体和20尾抗病个体的基因组DNA中扩增TLR22和TLR23基因片段,在TLR22中发现25个SNP位点和9个增添/缺失部位/位点,经分析初步确定与无乳链球菌抗性相关的16个SNP位点和3个增添/缺失部位。TLR23中发现20个突变位点,其中14个位点在编码区,6个位点在非编码区。两者尚未发现抗病相关的基因型。这些变异性位点的获得仅是在人工感染的感病和抗病群体中获得,我们拟在构建的家系中进行验证,以进一步分析其应用潜力。本研究结果为抗病尼罗罗非鱼选育奠定了基础。