胸腺肽β4(thymosin β4，Tβ4)是存在于多种动物的多种组织中的一种酸性肽，分子量为4982，PI为5.1，N端丝氨酸被乙酰化，它的cDNA序列和氨基酸序列已明确，含有2个a螺旋结构，分别位于第4-16和第30-40氨基酸残基之间，这种结构与肌动蛋白的结合相关。Tβ4在人和许多哺乳动物如羊、猪、牛、老鼠及其他脊椎动物如鸟类、两栖类的体内广泛分布，具有多方面的生物学活性。Tβ4是一种生物反应调节因子，能调节和增强人体免疫机能，促进淋巴细胞成熟、内皮细胞移动和附着、血管生成、神经再生、肿瘤转移、心肌修复、创伤愈合和抗炎症反应等。 本研究的目的是通过基因工程方法，将Tβ4基因克隆至表达载体pTXB1，在大肠杆菌中表达Tβ4，并将表达的Tβ4进行分离、纯化及生物学活性测定，以期获得能够高效表达、纯化简便的制备Tβ4方法。取得如下结果。 1.从Genebank中查得Tβ4 eDNA，将Tβ4基因序列的正义链和反义链拆分成10个互补的小片段，互为模板，由生物公司合成的10个互补的小片段，采用PCR两步法扩增出Tβ4全基因。根据Tβ4基因序列设计一对带有pTXB1的酶切位点—NdeⅠ和XhoⅠ的特异性引物，用此特异性引物扩增出Tβ4基因，然后将扩增出的目的片段连接至pMD18-T载体，连接产物转化至E．coli DH5a感受态，通过阳性克隆筛选、酶切鉴定、测序、基因比对，成功构建重组质粒pMD18-T-Tβ4。 2.将pMD18-T-Tβ4与原核表达载体pTXB1用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，pMD18-T-Tβ4被酶成两个片段，较小的片段为Tβ4基因片段，pTXB1被酶切为两个片段，较大的片段为目的片段。凝胶回收pMD18-T-T134酶切的小片段和pTXB1被酶切后的大片段，将回收的片段用连接试剂盒连接，并将连接产物转化至E．coli DH5a感受态进行阳性克隆筛选、酶切鉴定、基因测序、测序结果分析，构建重组质粒pTXB1-Tβ4。将重组质粒转化至E.coli BL21 codon plus，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，SDS-PAGE鉴定表达产物。 3.将表达产物超声裂解、几丁质(Chitin beads)柱亲和层析纯化，再经Tricine—SDS—PAGE鉴定表明，融合蛋白Tβ4在E．coli BL21 codon plus中已经高效表达，并获得较纯的重组Tβ4。将纯化产物用HiTrap Desalting脱盐柱脱盐、真空离心浓缩仪真空抽干、称重后，用PBS溶解Tβ4，BCA试剂盒测Tβ4浓度。最后用MTT法测定Tβ4对小鼠脾淋巴细胞的增殖活性，结果表明，重组Tβ4具有促进小鼠脾淋巴细胞增殖的活性，最适刺激浓度为1.6μg/mL。 通过本研究，获得Tβ4的高效表达的工程菌，并获得高纯度的重组Tβ4，探索了一种一步纯化具有生物学活性的重组Tβ4的简便方法，为进一步研究TB4的其他功能及作用机制奠定基础。