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急性心肌梗死(AMI)、不稳定心绞痛(UAP)、急性冠状动脉综合征(ACS)等心血管疾病引起的心肌损伤是危害人类健康的头号杀手,如能早期发现将对患者具有重大意义。但由于心肌结构及功能的特殊性,早期心肌损伤的检测受到较多的限制,多年来寻找诊断心肌损伤的各种生化标志物及其诊断方法一直是医学工作者努力探索的课题,但至今仍然没有一种能够完全满足临床需要的诊断标志物和诊断方法。 本研究在查阅大量文献资料和进行广泛的临床调查的基础上,选择心肌肌球蛋白作为心肌损伤的诊断标志物,围绕抗心肌肌球蛋白单克隆抗体的研制,开展了三个层次的研究工作。 抗心肌肌球蛋白单克隆抗体的制备 心肌肌球蛋白(Cardiac Myosin,CM)用于心肌损伤的诊断,较心电图和其它血清酶或肌红蛋白更敏感和特异。在心肌受到损伤或酸性pH时,由心肌肌球蛋白构成的粗肌丝发生裂解,CM轻链(CMLC)和重链(CMHC)释放入血,CMLC出现早且持续时间长,CMHC的结构特征决定其具有良好的特异性,所以心肌肌球蛋白的测定是迄今为止诊断心肌损伤和研究心肌损伤及保护较特异的生化指标,可用于AMI的早期诊断和后期治疗观察。由于猪与人的CM氨基酸序列存在99%以上的同源性,而人类心肌肌球蛋白抗原难以获得,所以我们采用猪CM代替人CM作为抗原免疫小鼠,经过七次融合,采取间接ELISA方法,从3000多个孔中筛选出14株,分别来自5个不同融和孔的能稳定分泌高效价的抗猪心肌肌球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。生物学初步鉴定结果显示,制得的单克隆抗体具有亲和力高,特异性强等特点。为下一步诊断方法的建立奠定了良好的基础。 心肌肌球蛋白双抗体夹心ELISA法的建立及初步应用 用制备的抗CM的单克隆抗体作为第一抗体包被酶标板,辣根过氧化物酶标记兔抗CM多肽抗体作为第二抗体,初步建立了双抗体夹心ELISA法,对血清中的心肌肌球蛋白可进行定性、定量地检测,利用标准曲线测定其最小检测下限为0.3ng/ml,标准曲线在1.0~20.0ng/ml范围内线性良好。初步应用于检测30例急性心肌急性心肌梗塞患者血清中CM水平,并与肌钙蛋白胶体金免疫层析试剂卡同期比较,表明两种方法的符合率为84.8%,并具有良好的重现性和稳定性。 心肌肌球蛋白胶体金免疫层析诊断方法的建立及初步应用 成功制备了性能稳定、免疫学活性好的金标CM多肽抗体,将其固定于玻璃纤维膜上作为显色源;抗CM单克隆抗体结合于硝酸纤维素膜上作为捕获抗体,制成免疫层析试纸条。该试纸条的检测灵敏度可达5ng/ml。捡测30例急性心肌梗塞患者血清CM水平,并与Roche肌钙蛋白胶体金免疫层析试剂卡比较,符合率达81.8%。该试剂条在4℃下至少可保存7.5个月。 结论:本研究成功制备了抗猪心肌肌球蛋白单克隆抗体,并将其应用在心肌肌球蛋白的诊断上,初步建立了ELISA方法利胶体金免疫层析试剂条法,研究表明这两种方法特异性强、稳定性好、操作简便,对心肌损伤的早期诊断具有一定的诊断价值,可为临床提供很好的参考。