目的:认知功能障碍性疾病特别是阿尔茨海默氏病、血管性痴呆等,是发生于老年前期和老年期十分常见的神经精神性疾病。其较为突出的临床特点为进行性学习记忆功能减退、行为障碍、情绪异常等。神经甾体参与焦虑、抑郁等应激情绪反应的调控,以及惊厥、睡眠、神经再生和生物昼夜节律等的调节。研究发现神经甾体对学习记忆具有调控作用。孕烯醇酮硫酸酯(pregnenolone sulfate, PREGS)和脱氢表雄酮硫酸酯(dehydroepiandrosterone sulfate, DHEAS)等神经甾体可协同促进γ-氨基丁酸受体GABAA的功能、抑制谷氨酸离子型受体NMDA的功能,进而增强神经元的兴奋性和突触可塑性,促进动物觉醒、记忆获取及巩固。而侧脑室给予别孕烯醇酮(allopregnanolone, AP)可损伤动物的空间认知能力。脑内胆碱系统参与学习、记忆、惊厥和注意力等许多活动。脑内乙酰胆碱(Acetycholine, Ach)水平的平衡对维持脑的高级功能的正常运作至关重要。不同脑区胆碱功能损伤、胆碱系统代谢酶水平改变以及胆碱能受体数目减少均与许多认知障碍性疾病的发生发展有关。Morris水迷宫进行的相关行为学评价可以用于疾病相关模型的判断。M受体东莨菪碱所致学习记忆损伤的大鼠模型被广泛应用,用以理解发生在老龄的记忆损害和特定的病理状态以及筛选具有促进认知功能的有效药物。本研究通过制备东莨菪碱所致学习记忆损伤的大鼠模型,测定模型动物的学习记忆能力以及神经甾体水平的变化,并进一步测定给予神经甾体干预后动物行为学及相关酶学指标,以探讨神经甾体对东莨菪碱所致学习记忆损伤模型大鼠的影响及其可能的机制,为学习记忆障碍性疾病机制的阐明和神经甾体的临床应用提供基础实验依据。方法:1分组和药物处理方案1.1东莨菪碱所致学习记忆损伤的大鼠模型的制备体重200~220g雄性Sprague Dawley (SD)大鼠16只,随机分为模型组和生理盐水对照组,每组8只。在水迷宫实验前30min模型组每只大鼠按2.0mg·kg-1腹腔注射东莨菪碱,对照组注射相应体积生理盐水。应用Morris水迷宫行为学实验对动物的学习记忆能力进行测试,与生理盐水对照组相比,行为学成绩显著降低表示模型制备成功。1.2孕酮对学习记忆损伤大鼠的影响及相关机制40只体重200~220g雄性SD大鼠,随机分为生理盐水对照组、模型组、孕酮低剂量组(4mg·kg-1)、孕酮中剂量组(8mg·kg-1)、孕酮高剂量组(16mg·kg-1),每组8只。水迷宫实验前60min,孕酮各剂量组每只大鼠背部皮下注射相应剂量孕酮,对照组和模型组大鼠背部皮下注射相应剂量的空白药用注射用油。实验前30min,模型组和孕酮各剂量组每只大鼠按2.0mg·kg-1剂量腹腔注射东莨菪碱,对照组大鼠腹腔注射相应体积生理盐水。2.指标的检测2.1 Morris水迷宫行为学测试第1~5天进行定位航行实验。每天在固定时间开始实验。将大鼠从固定入水点面向池壁放入水中,记录大鼠寻找并爬上平台的时间即逃避潜伏期,若大鼠在180s内未寻找到平台则记录逃避潜伏期为180s,并引导其寻找到平台。每只大鼠训练完毕后无论是否寻找到平台,均将其放至平台上停留10s。第7天进行空间探索实验。定位航行实验结束后间隔1天撤去平台,将大鼠从固定入水点面向池壁放入水中,记录大鼠第一次到达原平台所在位置的时间以及其在180s内跨越原平台所在位置的次数。2.2样品中神经甾体的提取和测定空间探索实验结束后将大鼠断头处死,取躯干血于肝素管中,并离心取上层血浆备神经甾体检测使用。迅速剥开颅骨,参考大鼠脑立体定位图谱,在冰冷的生理盐水中分离出皮质和海马,称重后置于-70℃下保存备神经甾体检测使用。参考本实验室已建立的方法稍加改进,使用乙酸乙酯/正己烷(9/1,v/v)液液萃取和固相小柱两步法提取神经甾体,采用高效液相色谱-质谱联用技术测定血浆和脑组织样品中的神经甾体的含量。2.3样品中乙酰胆碱酯酶的测定空间探索实验结束后将大鼠断头处死,迅速剥开颅骨,参考大鼠脑立体定位图谱,在冰冷的生理盐水中分离出皮质和海马,称重后用生理盐水制成10% (m/V)组织匀浆,4℃下3500r·min-1离心10min,取上清液参照试剂盒说明书严格操作进行反应测定。同时用紫外吸收法测定每个样本中蛋白含量以进行计算统计。结果:1神经甾体测定方法学确证本实验所用神经甾体测定方法中DHEA、PREG、AP、PROG和内标MT与脑组织及血浆成分分离效果良好,无干扰。脑组织样品和血浆样品中DHEA、PREG、AP和PROG在0.015~4.5ng·ml-1范围内具有良好的线性关系。脑组织中DHEA、PREG、AP、PROG日内和日间变异系数分别小于7.6%和7.2%、7.7%和7.9%、8.0%和5.7%、7.9%和4.5% (n=5);血浆中DHEA、PREG、AP、PROG的日内和日间变异系数分别小于8.1%和7.0%、6.7%和12.3%、8.0%和6.4%、8.1%和6.6% (n=5)。2 Morris水迷宫行为学测试结果定位航行实验结果显示,模型组和生理盐水对照组两组大鼠寻找到隐匿平台所需时间即逃避潜伏期均随学习天数的增加而呈现缩短趋势。与对照组相比,模型组大鼠逃避潜伏期在第3天开始显著延长(P<0.05)。空间探索实验中与对照组相比,模型组大鼠第1次到达原平台位置时间显著延长(P<0.05),跨越原平台所在区域次数显著减少(P<0.05)。说明东莨菪碱所致学习记忆损伤的大鼠模型制备成功。给予孕酮预处理后,定位航行实验结果显示在5天的训练过程当中随着训练时间的延长,各组大鼠的逃避潜伏期均呈现缩短趋势。与模型组相比,第3天开始,孕酮低、中剂量组大鼠的逃避潜伏期显著缩短(P<0.05),从第2天开始,孕酮高剂量组大鼠的逃避潜伏期显著缩短(P<0.05)。空间探索实验中,与模型组相比,孕酮三个剂量组大鼠第1次到达原平台位置时间均显著缩短(P<0.05)。与模型组相比,孕酮低、中剂量组大鼠跨越原平台所在区域次数与模型组有增加趋势,但差异没有显著性(P>0.05),孕酮高剂量组大鼠跨越原平台所在区域次数显著增加(P<0.05)。3样品中神经甾体水平的改变与生理盐水对照组相比,东莨菪碱致学习记忆损伤形成时,模型组大鼠额叶皮质内PREG水平显著下降(P<0.05),DHEA、AP和PROG水平无显著性改变;模型组大鼠海马内DHEA、PREG、AP和PROG水平无显著改变;模型组大鼠血浆中PROG水平显著升高(P<0.05),DHEA、PREG和AP水平无显著性改变。4样品中乙酰胆碱酯酶水平的改变与生理盐水对照组相比,东莨菪碱致学习记忆损伤形成时,模型组大鼠额叶皮质和海马中AchE活性显著升高(P<0.05)。与模型组相比,孕酮各剂量组大鼠额叶皮质和海马中AchE活性均降低(P<0.05)。结论:1 M受体拮抗剂东莨菪碱致大鼠学习记忆损伤时,脑内神经甾体合成代谢发生了明显改变,大鼠额叶皮质内PREG含量显著降低。提示神经甾体合成代谢可能参与了M受体系统对学习记忆的调节过程。2东莨菪碱致大鼠学习记忆损伤时,外周神经甾体合成代谢也发生了明显改变,血浆中PROG水平显著升高。推测东莨菪碱可能通过拮抗M受体影响内分泌系统,尤其是与甾体激素合成密切相关的HPA轴的活性,参与大鼠学习记忆相关脑区的调节。3外源性PROG干预能通过抑制脑内皮质和海马组织中AchE活性,改善东莨菪碱所致学习记忆损伤模型大鼠在水迷宫行为学实验中的成绩。提示PROG可能对改善东莨菪碱引起的大鼠学习记忆损伤具有保护作用。