【摘 要】
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紫杉醇是一种高效、低毒、广谱、作用机制独特的天然抗肿瘤药物。紫杉醇产生菌是一类内生真菌,主要指从红豆杉等树上分离出来的一类可产生紫杉醇的内生真菌。由于紫杉醇产生菌
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紫杉醇是一种高效、低毒、广谱、作用机制独特的天然抗肿瘤药物。紫杉醇产生菌是一类内生真菌,主要指从红豆杉等树上分离出来的一类可产生紫杉醇的内生真菌。由于紫杉醇产生菌的发现为微生物发酵法生产紫杉醇提供了可能性,因此,对紫杉醇产生菌的研究近年来得到了广泛的重视。
本文首先对从哈尔滨、合肥等地分离自杉树、柏树、海棠的6株疑似紫杉醇产生菌(05a、07c、31b、48c、62c、71a)的紫杉醇产生能力进行了鉴定。经过TLC法初步鉴定,其发酵产物中含有与紫杉醇标准品具有相同迁移率(Rf值)的物质;HPLC分析结果表明产物中含有与紫杉醇标准品具有相同的保留时间的物质;经质谱进一步确定,该物质与紫杉醇标准品具有相同的相对分子质量。
随后分别对这6株菌进行了形态学和分子生物学鉴定。形态学分析表明05a、48c和62c属于链格孢属(Alternaria),07c属于毛壳菌属(Chaetomium),31b和71a属于拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)。之后分别提取这6株菌的基因组DNA,通过PCR方法扩增18S rDNA,PCR产物均约为1.8 kb。通过对PCR产物的测序分析发现,其结果与形态学鉴定结果完全一致,与相应属的标准株相比,其18S rDNA相似性均在97%以上。最后通过DNAMAN和ClustalW软件对此6株菌进行分子系统进化树的构建,进一步确定了其分类地位。
最后,通过反向PCR方法和RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法,克隆了一株源于产紫杉醇丝状真菌Pestalotiopsis sp.NK-17的T-DNA单拷贝插入突变株TX-79的突变基因。该突变基因与咪唑酮丙酸酶基因(HutI)具有高度同源性。HutI基因与微生物的次级代谢的生物合成、转运和催化有关,故此推测该突变基因与紫杉醇的生物合成可能存在密切的关系,该基因的缺失或插入失活将直接影响菌株的紫杉醇生产合成能力。本实验将为进一步研究真菌中紫杉醇合成途径及机制提供基础。
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