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目的:卵巢癌是一种严重威胁女性健康的恶性肿瘤,由于卵巢癌临床症状出现晚,易于盆腹腔广泛种植播散,因此虽然手术治疗、化疗、生物治疗和基因治疗在卵巢癌治疗中广泛应用,5年生存率仍然仅为35-38%。因此针对卵巢癌发生机制的研究对于卵巢癌早期发现,早期诊断,早期治疗具有重要作用。非编码RNA(noncoding RNA)是指转录组中不翻译为蛋白质的RNA分子,包括相对分子量较小的核内小分子RNA(small nuclear RNA,snRNA)、核仁小分子RNA(small nucleolar RNAs,snoRNA)、微RNA(microRNA,miRNA)、piwi-interacting RNA(piRNA)以及相对分子量较大的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA),环状RNA(circular RNA,circ RNA)等。LncRNA作为一种新型的基因调控因子,参与调控了机体的许多过程如生长发育、细胞凋亡、增殖、分化、细胞自噬等,与肿瘤等多种疾病密切相关。由于lncRNA为长链结构,具有时空特异性以及组织特性,因而比miRNA更有潜力成为肿瘤的特异性靶标。LncRNA TDRG1(人类睾丸发育相关基因1)在骨髓间充质干细胞中过表达,但其在卵巢癌中的作用未见报道。本研究拟通过组织学、体内体外细胞学实验探索lncRNA TDRG1在卵巢癌增殖、凋亡、迁移、侵袭中的作用及机制,完善lncRNA TDRG1的网络通路,探讨lncRNA TDRG1能否成为卵巢癌治疗的治疗靶点。研究方法:1、通过qRT-PCR检测lncRNA TDRG1在上皮性卵巢癌组织以及正常卵巢组织中的表达水平,并分析lncRNA TDRG1表达水平与卵巢癌临床病理类型之间的相关性;2、通过构建lncRNA TDRG1野生型和突变型质粒,建立lncRNA TDRG1过表达的A2780以及OVCAR3卵巢癌细胞系,通过qRT-PCR确认过表达质粒的转染效率;3、通过MTT实验以及ki-67蛋白检测验证lncRNA TDRG1过表达对卵巢癌细胞A2780以及OVCAR3增殖活力的影响;4、通过Annexin V-PE/7AAD染色验证lncRNA TDRG1过表达对卵巢癌细胞A2780以及OVCAR3细胞凋亡的影响;5、通过划痕实验检测lncRNA TDRG1过表达对卵巢癌细胞A2780以及OVCAR3细胞迁移能力的影响;6、通过Transwell侵袭实验验证lncRNA TDRG1过表达对卵巢癌细胞A2780以及OVCAR3细胞侵袭能力的影响;7、通过构建lncRNA TDRG1的siRNA,建立lncRNA TDRG低表达的A2780以及OVCAR3卵巢癌细胞系,通过qRT-PCR确认siRNA的干扰效率;8、通过MTT实验以及ki-67蛋白检测验证沉默lncRNA TDRG1对卵巢癌细胞A2780以及OVCAR3细胞增殖活力的影响;9、通过Annexin V-FITC/PI染色验证沉默lncRNA TDRG1对卵巢癌细胞A2780以及OVCAR3细胞凋亡的影响;10、通过划痕实验检测沉默lncRNA TDRG1对卵巢癌细胞A2780以及OVCAR3细胞迁移能力的影响;11、通过Transwell侵袭实验验证沉默lncRNA TDRG1对卵巢癌细胞A2780以及OVCAR3细胞侵袭能力的影响;12、利用microRNA.org生物信息学网站预测lncRNA TDRG1具有可能的miRNA-93(miR-93)结合位点,双荧光素酶报告基因验证;13、通过qRT-PCR确认lncRNA TDRG1过表达/低表达对miR-93的影响;14、通过Western blot检测lncRNA TDRG1过表达/低表达对RhoC以及相关蛋白表达的影响;15、裸鼠皮下成瘤实验lncRNA TDRG1过表达对裸鼠体内成瘤的影响;16、利用SPSS对本实验所有数据进行统计分析,组间样本均采用双尾t检验。结果:1、qRT-PCR结果显示lncRNA TDRG1在上皮性卵巢癌组织中表达水平显著高于正常卵巢组织(p<0.05),且lncRNA TDRG1在中低分化卵巢癌中的表达水平显著高于高分化卵巢癌(p<0.05);2、MTT实验结果显示:与阴性对照组及空白对照组相比,过表达lncRNA TDRG1的A2780以及OVCAR3细胞增殖速度加快(p<0.05),western blot实验结果证明过表达lncRNA TDRG1后ki-67蛋白表达水平增高;3、细胞凋亡实验结果表明:与对照组相比,过表达lncRNA TDRG1抑制卵巢癌细胞A2780以及OVCAR3细胞凋亡(p<0.05);4、细胞划痕实验结果表明:与对照组相比,过表达lncRNA TDRG1促进卵巢癌细胞A2780以及OVCAR3细胞迁移(p<0.05);5、Transwell侵袭实验证明:与对照组相比,过表达lncRNA TDRG1促进卵巢癌细胞A2780以及OVCAR3细胞侵袭(p<0.05);6、MTT实验结果显示:与对照组相比,siRNA转染沉默lncRNA TDRG1表达后,A2780以及OVCAR3细胞活性降低(p<0.05),western blot实验结果亦证明ki-67蛋白表达下降;7、细胞凋亡实验结果表明:与对照组相比,沉默lncRNA TDRG1表达可促进卵巢癌细胞A2780以及OVCAR3细胞凋亡(p<0.05);8、细胞划痕实验结果表明:与对照组相比,沉默lncRNA TDRG1表达显著抑制卵巢癌细胞A2780以及OVCAR3细胞迁移(p<0.05);9、Transwell侵袭实验证明:与对照组相比,沉默lncRNA TDRG1表达显著抑制卵巢癌细胞A2780以及OVCAR3细胞侵袭(p<0.05);10、利用microRNA.org生物信息学网站预测lncRNA TDRG1的3’UTR区与miR-93存在结合位点,双荧光素酶报告基因实验证明miR-93 mimic可以显著下调lncRNA TDRG1 3’UTR野生型的荧光素酶活性(p<0.01),而对lncRNA TDRG1 3’UTR突变型的荧光素酶活性没有影响,且miR-93 mimic阴性对照组对lncRNA TDRG1 3’UTR野生型和突变型的荧光素酶活性都没有显著影响;11、qRT-PCR结果显示与对照组相比,lncRNA TDRG1过表达后抑制miR-93表达,而沉默lncRNA TDRG1可促进miR-93表达(p<0.05);12、Western blot结果显示与对照组相比,lncRNA TDRG1过表达后促进RhoC,P70S6K,Bcl-x L和MMP2蛋白表达,而沉默lncRNA TDRG1可降低RhoC,P70S6K,Bcl-x L和MMP2蛋白表达。13、裸鼠皮下成瘤实验结果表明:与对照组相比,lncRNA TDRG1过表达促进裸鼠体内成瘤,免疫组化结果表明lncRNA TDRG1过表达促进RhoC蛋白表达,qRT-PCR结果表明lncRNA TDRG1过表达抑制miR-93表达。结论:1、本研究首次证实在上皮性卵巢癌中,lncRNA TDRG1的表达水平显著高于正常卵巢组织,并且表达跟分化程度相关;2、lncRNA TDRG1在一定程度上促进卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,抑制细胞凋亡,发挥癌基因的作用;3、lncRNA TDRG1通过竞争性抑制miR-93,解除miR-93对靶蛋白RhoC的抑制,调节RhoC及其相关蛋白表达,促进卵巢癌发生发展。