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肝癌是我国最常见的一种消化道恶性肿瘤,其死亡率仅次于胃癌,是我国第二位的癌症杀手。肝癌发病隐匿,病情进展快,恶性程度高,治疗效果欠佳,大部分病人在出现症状时就诊已属于中晚期,进一步增加了其治疗难度。因此,肝癌的早期诊断是提高患者生存率的关键,找出能快速准确地诊断早期肝癌的方法,为肝癌患者争取治疗时间、提高疗效成为目前学者们广泛研究的热点问题之一。目前临床上用于诊断肝癌的血清标志物较多,如甲胎蛋白(α-Fetoprotein, AFP)及甲胎蛋白异质体3(AFP-L3)等,但它们普遍存在敏感度低、特异性不足等问题,寻找新的、特异性更高的诊断早期肝癌的血清标志物具有重要的临床意义。MicroRNAs (miRNAs)是一类非编码RNA,它参与调节许多重要的生理过程,现有许多研究表明,miRNAs还广泛参与了肿瘤的发生、发展、侵袭,被认为是潜在的肿瘤生物标志物。作为miRNAs中的一种,miR-200a被证实在肝癌中表达下调,与肝癌的发生具有一定的相关性。截至目前,相关研究文献报道较少且结论不一致。本课题拟通过建立DEN诱导的大鼠肝癌模型,建模期间动态检测大鼠外周循环血中miR-200a与AFP的表达情况并进行比较,旨在为研究miR-200a能否作为肝癌早期诊断的血清标志物提供依据。同时收集了部分临床病例血样,进行了miR-200a的检测,进一步为本研究结果的分析提供临床参考。实验一:DEN诱导的大鼠肝癌模型的建立方法:F344大鼠50只,随机分为正常对照组(C组,n=10)、实验组(E组,n=40)。E组大鼠给予腹腔二乙基亚硝胺(DEN)注射,按体重30mg/kg给药,3天1次,至第12周时停药。C组给予相同剂量及频率的生理盐水腹腔注射。实验过程中观察实验动物一般情况变化。自第8周起至第16周,每两周分别随机取E组动物8只及C组动物2只。称重后麻醉,开腹行腹主动脉取血,每只取4-5ml用于后续实验检测。取出肝脏进行大体观察及组织学分析。结果:C组大鼠饮食正常,反应灵敏,被毛柔顺有光泽, E组动物随给药时间延长饮食量逐渐下降,反应迟缓,被毛乱而无光泽。C组体重(301.28±55.04)g。E组体重(247.31±29.90)g,二者差异具有统计学意义(P<0.01)。实验中E组动物死亡4只,死亡率为10%。C组动物无死亡。肝脏大体观察及病理结果显示,E组动物肝脏病变过程经历了肝纤维化期、肝硬化期、早期肝癌及晚期肝癌。结论:通过小剂量DEN腹腔注射的方法,成功建立了大鼠肝癌模型。实验二:血清miR-200a及AFP在大鼠肝癌发生过程中的动态表达比较分析方法:实时定量PCR技术检测C组及E组不同时期大鼠血清miR-200a的相对表达情况,ELISA法检测血清AFP动态变化,将二者表达情况进行比较分析。结果:与正常组及纤维化期大鼠相比,miR-200a在肝硬化期、肝癌早期、肝癌晚期的大鼠血清均有不同程度下调(P<0.05),AFP在肝癌早期、肝癌晚期的大鼠血清明显上调(P<0.05)。与肝硬化期大鼠比较,肝癌晚期大鼠体内的miR-200a表达显著下调(P<0.05),AFP在肝癌早期、肝癌晚期均显著上调。结论:血清miR-200a参与了肝癌发生、发展,对于肝癌发生各个阶段均具有指示作用,可作为肝癌预防和早期诊断的一个潜在标志物。实验三: miR-200a及AFP在肝癌、肝硬化患者血清中表达比较分析方法:临床收集正常肝、肝硬化、肝癌患者(各12例)血液标本。运用实时定量PCR技术检测血清miR-200a的相对表达情况,血清AFP水平从临床资料中提取。结果:临床标本分析结果显示,miR-200a在肝硬化及肝癌患者中均显著下调(P<0.05),AFP仅在肝癌患者中出现异常表达。结论:血清miR-200a对肝硬化及肝癌具有一定的临床诊断价值。