研究背景间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)属于多潜能干细胞。相关研究表明,间充质干细胞对多种疾病具有治疗潜力,例如心肌梗死、神经性疾病和创伤愈合等。依据相关临床前期实验结果,针对多种疾病的临床试验正在逐渐开展中。MSCs分布于多种组织,如骨髓和脂肪组织,但数量极少。在骨髓的有核细胞中,干细胞只占约0.001%-0.01%。有研究证明,间充质干细胞也存在于脐带和胎盘,这增加了获取、使用间充质干细胞的可能性。然而想要获取足够量的间充质干细胞并应用于细胞治疗和组织工程,体外扩增仍然是其中的必需环节。MSCs长期以来被认为是可以无限传代、扩增的干细胞。近年来的研究表明，在培养、扩增过程中,间充质干细胞会迅速出现衰老现象,细胞形态表现出明显的变化,同时伴有许多旁分泌因子的分泌异常。Oct4, Sox2和Nanog是调控胚胎干细胞自我更新、维持干细胞多向分化潜能的主要转录因子。研究发现Oct4,Sox2和Nanog基因也在MSCs中表达并参与其多能性的调控。在MSCs体外培养、扩增过程中,伴随细胞形态学改变,这些基因也出现表达水平的快速下调。研究表明,MSCs的有限培养、扩增不会引起相关基因的DNA序列改变,多潜能相关基因无显著DNA甲基化现象。然而,MSCs的表观遗传状态在培养、扩增过程中并不稳定。前期研究表明,MSCs的体外培养、扩增会引起多潜能基因启动子区域组蛋白H3-K9、14的去乙酰化,与细胞的老化现象密切相关。曲古抑菌素A (Trichostatin A, TSA),最初作为抗真菌药物被广泛应用。最近研究发现TSA是一种有效的、特异性组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂。TSA选择性抑制Ⅰ类和Ⅱ类HDAC,但不能作用于Ⅲ类HIDAC。已证实TSA对乳腺癌细胞有明显抑制作用和细胞毒性。根据不同的细胞类型和功能状态,TSA可参与调节多种不同的细胞活动,如细胞分化和细胞增殖等。本研究设计、使用曲古抑菌素A (TSA),作为组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂,抑制MSCs体外培养、扩增引起的组蛋白去乙酰化,从而保持其原始性状。第一部分人间充质干细胞的体外分离、培养、扩增及多潜能相关基因的检测研究研究目的：体外分离、纯化、扩增人胎盘组织来源的间充质干细胞,密切观察MSCs的细胞形态变化,探讨体外扩增对MSCs干细胞形态学特性的影响；检测多潜能相关基因、成骨分化相关基因的mRNA含量,探讨体外扩增过程对MSCs多潜能相关基因、成骨分化相关基因转录水平的影响。方法：1.胰酶消化、贴壁培养法体外分离培养并纯化鉴定MSCs:取38W-40W妊娠,健康供者的人胎盘组织,用预冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤数次,机械剁碎后,37℃水浴下0.25%胰蛋白酶消化30分钟。离心后用含10%胎牛血清和抗生素的DMEM培养基重悬沉淀、种板。37℃、5%CO2培养,隔天换液。待细胞达到80%融合时,0.25%胰蛋白酶/EDTA消化、连续传代、培养；流式细胞仪对MSCs的相关表面标志物进行检测鉴定。2.体外扩增MSCs、观察细胞形态学变化并绘制扩增曲线：选取体外分离、纯化并鉴定成功的MSCs,当细胞生长到80%融合或以上时,连续传代、培养至10代以上。绘制细胞生长曲线,观察细胞形态学变化。3. Real-Time PCR检测体外扩增MSCs多潜能相关基因、成骨分化相关基因转录水平：设计、合成多潜能相关基因Oct4、Sox2、Nanog、Rexl和TERT、CD133,成骨分化相关基因ALP和OPN引物,Real-Time PCR检测第1代与连续传代后(第10代)MSCs多潜能相关基因、成骨分化相关基因mRNA相对含量。结果：1. MSCs的体外分离、纯化：使用胰酶消化法、贴壁培养法,成功完成MSCs体外分离、纯化并鉴定成功。2. MSCs的体外扩增：采集对数生长期的细胞,进行连续传代,实现MSCs体外扩增。观察细胞形态可见：伴随扩增过程进展,MSCs形态发生显著性改变,表现为细胞增大、不均匀,形态增宽,变扁平。细胞生长曲线提示细胞增殖速度较快,细胞总数呈指数增长。3.体外扩增MSCs多潜能相关基因、成骨分化相关基因的转录水平改变：应用Real-Time PCR检测体外扩增过程中MSCs多潜能相关基因、成骨分化相关基因的mRNA表达,结果显示：体外扩增的第10代MSCs与第1代相比,多潜能相关基因Oct4、Sox2、Nanog、Rex1和TERT、CD133,转录水平显著降低,成骨分化相关基因ALP和OPN,转录水平显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论：1.胰酶消化法、贴壁培养法可以成功分离、纯化人胎盘组织来源的MSCs。2.传统方法体外扩增MSCs,不能有效维持其干细胞的形态学特征,伴随传代次数增加,细胞形态学变化显著。3.传统方法体外扩增MSCs,不能有效维持干细胞多向分化潜能,参与维持MSCs多向分化潜能的干细胞多潜能相关基因转录水平下调。4.传统方法体外扩增MSCs,不能维持干细胞的未分化状态,出现向成骨细胞分化的自主分化趋势,MSCs成骨分化相关基因转录水平上调。第二部分去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(Trichostatin A, TSA)促进MSCs增殖、稳定MSCs形态的功能及机制研究研究目的：TSA短期处理MSCs,筛选最佳作用浓度,观察TSA对MSCs细胞形态学和细胞增殖的影响；TSA长期培养MSCs,辅助体外扩增,验证TSA稳定MSCs细胞形态和促进细胞增殖的作用。检测TSA处理对MSCs细胞周期的影响,探讨TSA促进MSCs细胞增殖的作用机制。方法：1.梯度浓度TSA短期处理MSCs、观察细胞形态学改变并计数细胞增殖情况：体外分离、纯化的第3代MSCs,分别使用含0、6.25、12.5、25、50、100、200和300nM TSA的培养基,对细胞进行连续培养三天。观察梯度浓度TSA处理组细胞形态差异,计数细胞数目变化。2.低浓度TSA长期处理MSCs、观察细胞形态学改变并计数细胞增殖情况：体外分离、纯化的第1代MSCs,分别使用含6.25nM TSA、等量DMSO(TSA溶剂)的完全培养基,对细胞进行连续培养、传代、计数。观察TSA处理组与DMSO对照组细胞形态差异,计数细胞数目变化,绘制生长曲线,检测细胞增殖速度变化。3.流式细胞仪检测TSA处理对MSCs细胞周期的影响：体外分离、纯化的第1代MSCs,分别使用含6.25nM TSA、等量DMSO (TSA溶剂)的完全培养基,对细胞进行连续培养。检测完全融合的第10代MSCs,细胞周期各阶段的细胞比例；检测30%融合的第11代MSCs,细胞周期各阶段的细胞比例。4. Western Blot检测TSA处理对MSCs细胞周期相关蛋白的影响：体外分离、纯化的第1代MSCs,分别使用含6.25nM TSA、等量DMSO (TSA溶剂)的完全培养基,对细胞进行连续培养。采集TSA处理组与DMSO对照组第6代、第10代MSCs,检测细胞周期相关蛋白Cyclin B1、Cyclin D1和p21的表达。结果：1.TSA短期处理对MSCs细胞形态学和细胞增殖的影响：梯度浓度TSA对MSCs短期培养三天,观察MSCs细胞形态学变化及细胞增殖变化。结果显示：较低浓度TSA(6.25nM、12.5nM)培养的MSCs细胞总数显著性增多,差异具有统计学意义(P<0.01)；细胞数目增多的同时,细胞的形态学特征保持良好。较高浓度TSA(200nM、300nM)培养MSCs与低浓度TSA的培养效果相反,引起细胞总数显著性降低(P<0.01)；同时细胞形态异常改变,细胞增大,形态趋于扁平,丧失MSCs的形态学特征2.TSA长期处理对MSCs细胞形态学和细胞增殖的影响：体外分离、纯化的第1代MSCs,分别使用含6.25nM TSA、等量DMSO(TSA溶剂)的完全培养基,进行体外扩增至第10代,观察细胞形态学变化和细胞增殖变化。结果显示：TSA处理组与DMSO对照组比较可见：TSA处理组细胞增殖速度、细胞总数较DMSO对照组显著性增加,差异具有统计学意义(P<0.01)；同时TSA处理组细胞的形态学特征保持良好,DMSO细胞形态显著改变；TSA处理组与DMSO对照组的MSCs,细胞的接触抑制均存在,即当细胞生长到充分融合时,细胞增殖就会停止,不会出现局灶性的多层细胞(细胞接触抑制+)3.TSA处理对MSCs细胞周期的影响：体外分离、纯化的第1代MSCs,分别使用含6.25nM TSA.等量DMSO (TSA溶剂)的完全培养基,进行体外扩增。取达到完全融合的第10代MSCs应用流式细胞仪进行细胞周期的检测,结果显示TSA处理组与DMSO对照组相比,处于G1期、S期的细胞比例相似(TSA组：G1期77%、S期17.9%,DMSO组：G1期76.7%、S期17.9%),二者无统计学差异(P>0.05)。将完全融合的第10代MSCs传代培养24h后(第11代,30%融合),流失细胞仪进行细胞周期的检测,结果显示：TSA处理组有较高比例的MSCs从G1期进入S期(G1期23.2%、S期68.7%),与DMSO对照组相比(G1期27.9%、S期62.7%),差异有统计学意义(P<0.05)。4.TSA处理对MSCs细胞周期相关蛋白的影响：Western Blot检测分别检测TSA处理组与DMSO对照组完全融合的第6代、第10代MSCs的细胞周期相关蛋白表达,结果显示：TSA处理组与DMSO对照组,细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D和p21的表达无显著性差异(P>0.05)结论：1.低浓度TSA,辅助体外扩增MSCs,可以有效稳定MSCs的干细胞形态学特性。2.低浓度TSA,辅助体外扩增MSCs,可以显著提高MSCs的细胞增殖速度。3. MSCs对TSA药物浓度反应敏感。高浓度TSA,反而导致细胞形态异常改变,并且对MSCs的细胞增殖速度有抑制作用。4.低浓度TSA对MSCs细胞增殖的促进作用,是通过调节MSCs的细胞周期实现的,即通过提高进入S期的细胞比例,显著提高细胞增殖速度。5.低浓度TSA对MSCs细胞增殖的促进作用,不会引起MSCs相关细胞周期蛋白过度表达,进而不会引起细胞增殖失控、细胞恶性转化。第三部分去乙酰化酶抑制剂TSA对MSCs多分化潜能的影响及多潜能相关基因的调控研究研究目的：低浓度TSA长期培养后,分别诱导MSCs向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化,探讨TSA对MSCs多向分化潜能的影响。检测TSA处理后MSCs多潜能相关基因的转录水平及启动子区域组蛋白乙酰化水平,探讨TSA对MSCs多潜能相关基因的影响及机制,分析TSA维持MSCs细胞形态稳定性及细胞多向分化潜能的原理。方法：1.使用脂肪诱导培养基,诱导TSA处理后的MSCs向脂肪细胞分化：体外分离MSCs,分别用含6.25nM TSA、含等量DMSO的完全培养基,连续培养、传代至第6代。更换诱导MSCs向脂肪细胞分化的培养基(含10-6M地塞米松,10μg/ml胰岛素和100μg/ml3-异丁基-L-甲基黄嘌呤),培养3周后,使用油红染色鉴定。2.使用成骨诱导培养基,诱导TSA处理后的MSCs向成骨细胞分化：体外分离MSCs,分别用含6.25nM TSA、含等量DMSO的完全培养基,连续培养、传代至第6代。更换诱导MSCs向成骨细胞分化的培养基(含10"7M地塞米松,50μg/ml抗坏血酸和10mM β-磷酸甘油),培养3周后,使用茜素红染色鉴定。3.使用软骨诱导培养,诱导TSA处理后的MSCs向软骨细胞分化：体外分离MSCs,分别用含6.25nM TSA、含等量DMSO的完全培养基,连续培养、传代至第6代,Pellet微球法培养。更换诱导MSCs向软骨细胞分化的培养基(50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸,100μg/ml丙酮酸,10ng/ml TGF-β1和50mg/ml ITS Premix),培养3周后,组织固定、切片,HE染色、甲苯胺蓝染色鉴定。4.Real-Time PCR检测,低浓度TSA辅助扩增,对MSCs多潜能相关基因转录水平的影响：Real-Time PCR检测TSA处理组.DMSO对照组第6代MSCs与第1代MSCs,多潜能相关基因,Oct4、Sox2、Nanog、Rex1和TERT、 CD133mRNA的相对含量。5.染色质免疫共沉淀(ChIP)法检测,低浓度TSA辅助扩增,对MSCs多潜能相关基因启动子区域组蛋白乙酰化水平的影响：使用特异性抗体,将与目的蛋白结合的DNA片段特异性沉淀、分离出来,Real-Time PCR检测特异性DNA片段的含量,间接反映细胞内与DNA片段结合的目的蛋白水平。检测TSA处理组、DMSO对照组第6代MSCs与第1代MSCs,多潜能相关基因启动子区域组蛋白乙酰化水平变化。结果：1.低浓度TSA,辅助体外扩增对MSCs脂肪细胞分化潜能的影响：对向脂肪细胞诱导的TSA处理组与DMSO对照组细胞进行油红染色。结果显示：两组细胞均可见细胞胞浆鲜红色脂肪颗粒着色,表明间充质干细胞已分化为脂肪细胞。2.低浓度TSA,辅助体外扩增对MSCs成骨细胞分化潜能的影响：对向成骨细胞诱导的TSA处理组与DMSO对照组细胞进行茜素红染色。结果显示：两组细胞均可见染料与钙颗粒结合后显示的红色颗粒,表明间充质干细胞已分化为成骨细胞3.低浓度TSA,辅助体外扩增对MSCs软骨细胞分化潜能的影响：对向软骨细胞诱导的TSA处理组与DMSO对照组细胞进行组织切片后HE染色染色。结果显示：两组切片均显示细胞变小,胞核变小,胞浆变少,可见胞浆、胞核的空壳,细胞外基质苏木素着色,为透明软骨细胞样外观；组织切片后甲苯胺蓝染色显示胞浆内外紫红色着色。均表明间充质干细胞已分化为软骨细胞。4.低浓度TSA,辅助体外扩增MSCs对多潜能相关基因转录水平的影响：Real-Time PCR检测MSCs多潜能相关基因mRNA表达。结果显示：DMSO对照组的第6代MSCs与第1代MSCs相比,多潜能相关基因Oct4、Sox2、 Nanog、Rexl和TERT、CD133的转录水平明显下调,差异具有统计学意义(P<0.01)。与DMSO对照组相比,TSA处理组的第6代MSCs,其多潜能相关基因转录水平下调,被显著性抑制(P>0.05)5.低浓度TSA,辅助体外扩增MSCs对多潜能相关基因启动子区域组蛋白乙酰化水平的影响：染色质免疫共沉淀(ChIP)结果显示, DMSO对照组的第6代MSCs与第1代MSCs相比,多潜能相关基因启动子区域组蛋白H3的乙酰化水平显著性降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。与DMSO对照组相比,TSA处理组的第6代MSCs,其多潜能相关基因启动子区域组蛋白H3的乙酰化水平下调,被显著性抑制(P>0.05)。结论：1.低浓度TSA,辅助体外扩增MSCs,可以有效逆转多潜能相关基因的转录水平下调。2.低浓度TSA,辅助体外扩增MSCs,可以有效维持MSCs向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞的多向分化潜能。3.低浓度TSA,辅助体外扩增MSCs,是通过抑制基因启动子区域的组蛋白去乙酰化,激活基因转录,抑制多潜能相关基因的转录水平下调,从而有效维持MSCs的多向分化潜能。