角膜感染、外伤、热及化学性烧伤、先天性异常、反复复发的翼状胬肉和肿瘤等疾病严重损伤眼表组织，造成视力下降，甚至致盲。角膜盲的患者在盲病人中占相当比例，由于眼表疾病以及角膜缘干细胞缺失所导致的角膜盲欠缺有效治疗手段，故对其治疗一直是步履蹒跚。粘膜或结膜移植眼表重建手术的临床效果较差，因为粘膜和结膜与角膜上皮表型不同而不能恢复眼表正常的形态与功能，最终导致新生血管化。同种异体板层角膜移植供体来源匮乏，冷冻保存的植片由于角膜缘干细胞的失活不能改善重建正常的眼表。随着对角膜缘干细胞在维持眼表中的重要作用的不断认识，角膜缘干细胞移植成为目前的研究热点。1998年12月美国科学家在《science》上报导，成功地在体外培养和扩增了人体胚胎干细胞，这一研究为利用干细胞治疗疾病提供了理论依据。一年之后，美国科学家发现小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横向分化”为血液细胞，这一发现陆续被世界各国科学家所证实。随着研究的深入，人们还发现人类的成体干细胞同样具有“横向分化”的功能，这也表明人类有望利用患者自身健康组织的干细胞，定向诱导分化成有功能的细胞用于治疗疾病。随着干细胞研究的深入，组织工程学也应运而生，组织工程技术的兴起为解决眼表重建的难题带来了希望。组织工程技术的基本方法是取少量自体健康角膜缘组织，体外培养扩增后种植于一种生物相容性良好的载体上，组成复合角膜上皮植片后移植到患侧眼表。其优点在于：取材量少、健眼损伤小、解决了供体来源问题、不存在免疫排斥反应。角膜缘干细胞经体外培养后其抗原性会有所降低，这就更有利于异体移植。因此，角膜缘干细胞培养后移植解决了干细胞来源不足的问题，对异体角膜缘干细胞的体外培养是目前研究的重点，是治疗眼表疾病最有前途的治疗方法。目前角膜缘干细胞理想的培养体系还处于探索研究阶段，正确获取培养用角膜缘组织是体外成功培养角膜缘干细胞的首要因素，但由于角膜缘干细胞缺乏明确的阳性标志，对其的研究一直在进行中。还有角膜缘干细胞体外培养时，细胞增殖、分化等过程的调节受许多因素制约，其中许多环节人们还知之甚少。如能在这些方面有所突破，有望产生巨大的社会效益和经济效益，并为数以十万计的角膜盲患者带来福音。基于上述，本实验研究利用组织工程学、细胞生物学和干细胞与干细胞工程学的基本原理与方法，试图在体外成功培养角膜缘干细胞、构建组织工程化角膜上皮，并将组织工程化角膜上皮移植于动物模型，以达到重建眼表、恢复角膜表面的光滑和透明，恢复眼表面较为正常的解剖结构和功能，为进一步组织工程化眼表重建奠定理论和实验基础。在本研究中应用体外组织培养方法，对兔角膜上皮前体细胞或角膜缘干细胞(祖细胞)存在的确切部位和生理特性、在完整羊膜和去上皮层羊膜为载体培养的生物学特性和以去上皮层羊膜为载体培养后自体及异体移植治疗全角膜缘干细胞缺损以及临床应用等情况进行了实验，主要方法和结果概括如下：一．应用体外组织培养方法，以兔角结膜分界线(Cornea-Conjuctiva Line CCL)为基准，分成8个定位区带，并分别以12点、3点、6点、9点为中心，取材进行体外培养。逐日观察细胞成膜状态，测量成膜面积并进行统计学分析。结果显示：1．角膜缘不同区域的上皮组织在细胞生长时间、成膜时间、成膜速率以及成膜类型方面具有明显差异(P＜0.01)，角膜缘附近的角膜上皮细胞生长最快、出膜最早、膜状态最好。2．CCL内各区组培养后均无成纤维细胞出现；而CCL外各区组培养后可见成纤维细胞，距CCL线越远成纤维细胞数量越多。3．水平方位与垂直方位即12点位、6点位、3点位和9点位的角膜上皮前体细胞成膜形态与成膜规律的比较，发现二者不存在明显差异(p＞0.05)。4．角膜缘附近的角膜上皮细胞体外培养形成的膜都是完整、均质、透明的，当膜在其增长过程中，可将扩展范围内的成纤维细胞化解。提示：1．角膜缘不同定位区组织细胞形成膜的特性不同，含有干细胞的角膜缘附近的角膜上皮细胞生长最快、出膜最早、膜状态最好。2．角膜缘部栅栏组织的丰富程度与角膜上皮前体细胞的数量及功能未必存在一致关系。3．角膜缘干细胞形成的膜有保持其透明性及排它性的生理特性。4．进行角膜缘干细胞体外培养，从CCL附近取材较为适宜。二．对兔角巩膜缘不同定位区的角结膜上皮细胞进行体外组织培养，探讨了角膜缘干细胞的生理特性。结果显示：1．当角膜缘上皮细胞形成的膜片相互融合时，他们之间是兼容连接，最终形成的膜片之间无连接的痕迹。2．当角膜缘上皮细胞形成的膜片与结膜上皮细胞形成的成纤维细胞融合时出现相互竞争现象。3．角膜缘存在有角膜缘干细胞，角膜缘上皮细胞形成的膜有保持其透明性及排它性的生理表现。提示：1．角膜缘上皮细胞和结膜上皮细胞存在相互竞争机制，为角膜缘干细胞缺乏症引起的角膜结膜化提供了必要的实验基础。2．角膜缘存在有角膜缘干细胞，角膜缘干细胞对维持角膜的透明性和正常生理功能有重要意义。三．采用组织块培养法，将角膜缘及角膜中心组织块分别种植于完整羊膜和去上皮层羊膜上进行培养，观察并比较在完整羊膜、去上皮层羊膜为载体培养兔角膜上皮细胞的生物学特性。结果显示：1．角膜上皮细胞在去上皮层羊膜上培养成膜速率与成膜面积方面均快于在完整羊膜上培养，去上皮层羊膜更利于角膜上皮细胞的生长。2．角膜上皮细胞在完整羊膜上培养，当膜在其增长过程中，需将扩展范围内的羊膜上皮细胞推开，膜才能继续增长。提示：1．不同性质羊膜为载体对角膜上皮细胞的生物学特性有一定的影响，去上皮层羊膜更利于角膜上皮细胞的生长，可作为一个良好的载体用于移植。2．角膜上皮细胞具有排它性的生理特性，对维持角膜的透明性和正常生理功能有重要意义。四．制作兔眼(以右眼为实验眼)角膜缘干细胞完全缺损模型3个月，将实验动物随机分为两组即实验组和对照组。实验组取对侧眼角膜缘组织以去除上皮细胞的羊膜基底膜为载体制成组织工程角膜上皮，约培养后12天行角膜缘干细胞羊膜移植术；对照组行单纯羊膜移植术(仅将刮除上皮的羊膜)，术后观察3个月。以角膜上皮染色，角膜浑浊和新生血管三项指标进行临床疗效评定，通过病理检查评估术后角膜上皮修复情况，印迹细胞学检查移植前后角膜上皮的细胞表型。结果显示：1．体外培养的兔角膜缘干细胞可在羊膜上粘附生长并增殖。2．自体角膜缘干细胞移植术后兔角膜缘轻度充血、角膜上皮逐渐愈合，透明度提高，基质细胞浸润减轻，新生血管减退或消失。印迹细胞学检查显示：移植前角膜上皮细胞PAS(+)，而移植后角膜上皮细胞PAS(-)；组织病理学显示：移植前角膜上皮大部分缺损，移植后角膜上皮为角膜上皮结构。提示：以羊膜为载体培养角膜缘上皮细胞可体外重建组织工程角膜上皮组织，自体角膜缘干细胞羊膜移植术可修复角膜缘干细胞缺损。五．制作兔眼角膜缘干细胞完全缺损3个月的模型，将实验动物随机分为两组即自体移植组和异体移植组。自体移植组取对侧眼角膜缘组织，异体移植组取健康的兔眼角膜缘组织，均以去除上皮细胞的羊膜基底膜为载体，培养12天后行角膜缘干细胞羊膜移植术。术后观察3个月，以角膜上皮染色、角膜浑浊和新生血管三项指标进行临床疗效评定，通过病理检查评估术后角膜上皮修复情况，印迹细胞学检查移植前后角膜上皮的细胞表型。结果显示：体外培养的兔角膜缘干细胞可在羊膜上粘附生长并增殖，体外培养12天可形成复层。自体移植组和部分异体移植组术后角膜上皮逐渐愈合，透明度提高，基质细胞浸润减轻，新生血管减退或消失。印迹细胞学检查显示：移植前角膜上皮细胞PAS(+)，而移植后转为(-)；组织病理学显示：移植前角膜上皮大部分缺损，移植后呈现角膜上皮结构。部分异体移植组术后出现了免疫排斥反应。提示：自体角膜缘干细胞羊膜移植术可重建眼表；免疫排斥反应仍是异体角膜缘干细胞羊膜移植术失败的主要原因。六．我们选择两例眼烧伤后重度睑球粘连患者，观察以去除上皮细胞的人羊膜基底膜为载体，，自体血清培养异体角膜缘上皮细胞后移植治疗眼烧伤后重度睑球粘连，术后观察结膜囊情况、眼球活动、角膜植片免疫排斥反应情况和转归情况。探讨以人自体血清、人羊膜为基底膜培养角膜缘上皮细胞后移植治疗眼烧伤后重度睑球粘连的眼表重建效果。结果显示：术后患者自觉症状轻，视力有所提高，角膜缘干细胞移植片紧密贴附，角膜上皮得到修复，浅层新生血管减少，睑球粘连得到松解。提示：自体血清培养异体角膜缘上皮细胞后移植是治疗眼烧伤后重度睑球粘连的有效方法。本研究通过体外培养角膜缘上皮细胞生理特性，进一步证实了角膜干细胞存在于角膜缘的观点，验证了角膜缘干细胞对维持角膜的透明性和正常生理功能有重要意义的说法。通过观察并比较在完整羊膜与去上皮细胞层羊膜为载体培养兔角膜缘上皮细胞的生物学特性，表明去上皮细胞层羊膜可作为一个良好的载体用于移植。并以去上皮细胞羊膜作为载体，经培养后用于移植于全角膜缘干细胞缺损模型，可达到重建眼表。通过以去上皮细胞羊膜作为载体，人自体血清培养异体角膜缘上皮细胞后移植是治疗眼烧伤后重度睑球粘连的有效方法，避免了鼠源性3T3细胞饲养层和胎牛血清传播异种动物的风险，并降低了术后的免疫排斥反应，为眼表重建术提供另一研究新方向。